一种细菌质粒ＤＮＡ提取的方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学，具体地说是一种细菌质粒ＤＮＡ的提取方法。具体为将微生物菌体在液体培养基中，２５－３０℃振摇过夜培养；将培养过夜的菌液中加入缓冲溶液，离心收集和洗涤得裂解菌体；质粒ＤＮＡ的分离纯化，所得到的质粒ＤＮＡ可直接用于酶切、ＰＣＲ等多种分子生物学实验。本发明专利技术操作简便、安全、质量高、同时适用于革兰氏染色阴性细菌、革兰氏染色阳性细菌质粒ＤＮＡ的提取，因此具有广泛的适用性。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种细菌质粒ＤＮＡ提取的方法，其特征在于：１）细菌的培养：将挑取的细菌单菌落在细菌常用液体培养基中，２５－３０℃振摇过夜培养；２）菌体的收集、裂解：当细菌为革兰氏染色阴性菌时，取１．５－２．０ｍＬ培养１６－２４小时的菌液，并在１００００－１２０００ｒｐｍ下离心３０－６０秒，收集菌体；用１－１．５ｍＬＳＴＥ溶液洗涤两次，１００００ｒｐｍ离心３０秒；而后在细菌沉淀中加入１００－３００μＬ溶液Ⅰ，再加入２００－６００μＬ溶液Ⅱ，冰浴３－５分钟，得裂解菌液；当为革兰氏染色阳性菌分别培养时，取３．０－４．０ｍＬ培养１０－１６小时的菌液，并在８０００－１００００ｒｐｍ下离心６０－９０秒，收集菌体；用２．０－３．０ｍＬＳＴＥ溶液洗涤两次，１００００ｒｐｍ离心３０秒；而后在细菌沉淀中加入１００－２００μＬ溶液Ⅰ和５０－１００μＬ溶菌酶，３７℃水浴３０－６０分钟，然后再加入２００－６００μＬ溶液Ⅱ，冰浴３－５分钟，得裂解菌液；３）质粒ＤＮＡ的复性、与染色体ＤＮＡ分离：在步骤２）中得到的裂解菌液内加入１５０－４００μＬ溶液Ⅲ，冰浴１５－２０分钟，４℃下以１２０００ｒｐｍ离心１０分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置５分钟，４℃下再以１２０００ｒｐｍ离心５分钟，取其沉淀待用；４）质粒ＤＮＡ的沉淀：将步骤３）中的沉淀用１００－４００μＬ无菌重蒸水溶解，并加入溶解沉淀的无菌水的１／２体积的７．５ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］ＮＨ↓［４］Ａｃ和５ｍｏｌ.Ｌ↑［－１］ＬｉＣｌ，冰浴３－５分钟，４℃下以１２０００ｒｐｍ离心５分钟，取上清；并在上清液中加与其等体积的异丙醇，室温放置４０分钟，沉淀即为质粒ＤＮＡ；其中：溶液Ⅰ为５０ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖，２５ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ.Ｃｌ，ｐＨ８．０和１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ，ｐＨ８．０；溶液Ⅱ为０．２ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ和１％ＳＤＳ；溶液Ⅲ为溶液中含钾的浓度为３－５ｍｏｌ／Ｌ的ＫＡｃ，和５ｍｏｌ／Ｌ乙酸根，ｐＨ４．８；ＮＨ↓［４］Ａｃ和ＬｉＣｌ之间的摩尔比例是１∶１。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑乐，刘宛，李培军，张利红，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]