一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法及其试剂盒与应用技术

本发明专利技术提供一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其中，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体，共转染人少突胶质祖细胞，可高表达该两个神经胶质生长因子，即生长相关因子43和神经胶质生长因子2，发挥两者共同作用促进少突胶质细胞的修复，抑制少突胶质细胞损伤后的增生反应和胶质瘢痕形成，而造成的神经二次损伤；同时也利用了少突胶质祖细胞自身增殖分化能力，参与神经功能的修复，无成瘤性；并提供一种制备该抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒。本发明专利技术提供的人少突胶质祖细胞将对神经系统疾病有着很好的治疗效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法以及通过所述方法获得抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞，特别地，本专利技术涉及构建含两个神经胶质生长因子的病毒表达载体，使得人少突胶质祖细胞能稳定表达该两个神经胶质生长因子，共同发挥两者生物学功能；并提供一种制备该抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的试剂盒。本专利技术提供的人少突胶质祖细胞保持良好的增殖能力，参与神经功能的修复，而无成瘤性，可望用于临床治疗神经系统疾病，促使受损神经细胞的修复。
技术介绍
神经系统疾病在缺血、缺氧和损伤等情况下，造成星形胶质细胞损伤后钙离子浓度明显变化，激活细胞内钙离子信号传导并参与星形胶质细胞损伤后的增生反应，星形胶质细胞异常增殖造成了胶质瘢痕的形成，阻碍了损伤神经轴突有效再生和生长，主要为中枢神经损伤性疾病，即外伤性脑损伤、脑出血、脑缺血和脊髓损伤等。神经损伤早期星形胶质细胞处于成熟早期，可以分泌细胞因子维持和促进神经元功能发挥，并起到神经组织支架的作用；但其成熟以后，早期具有的多种有益功能逐渐消失，反而分泌有害因子，形成化学性胶质屏障，影响神经再生，阻碍轴突延长。位于损伤界面内成熟的星形胶质细胞显示有抑制轴突生长的蛋白聚糖表达，并且在瘢痕组织的形成中起主要的作用。胶质细胞过度增生和胶质瘢痕形成，导致机械性障碍，影响轴突的再生、延长和融合，并且可以形成微血管套，压迫微血管，影响局部的血液供应，这些均对神经细胞造成了二次损伤作用。本专利技术申请人意外发现，成体干细胞分泌的神经胶质生长因子在神经二次损伤抑制中发挥了重要的作用，其可以改善机体微环境，促进干细胞和内源性
的干细胞修复作用，但是干细胞分泌的神经胶质生长因子是非常有限的，有研究认为实际上干细胞移植治疗，真正发挥作用的是其分泌的神经胶质生长因子。本专利技术将构建好的含两个神经胶质生长因子片段，重组到病毒载体上，共转染人少突胶质祖细胞后表达两个神经胶质生长因子，共同发挥两者的生物学功能，而无成瘤性，具有良好的协同效果。人少突胶质祖细胞来源方便，主要包括脐血、胎盘血、骨髓和流产胎脑等，细胞培养获得简单，可以做到个体化，也可以使用免疫原性低的异体细胞。因而，本专利技术表达两个神经胶质生长因子的人少突胶质祖细胞制备简单，高表达两个神经胶质生长因子，抑制星形胶质细胞异常增殖和胶质瘢痕形成，共同创造有利于神经再生的微环境，抑制神经的二次损伤，有望对中枢损伤性疾病产生更佳的治疗效果。
技术实现思路
近年来干细胞治疗神经系统疾病的临床疗效得到广泛的认可，干细胞移植促进了神经细胞修复及神经再生，改善神经轴突和行为功能恢复。中枢神经损伤性疾病后期因小胶质细胞激活引发了星形胶质细胞成熟和异常增殖，导致胶质瘢痕形成和神经炎症反应，对神经细胞造成了二次损伤。本专利技术基于我们前期研究工作基础，利用人少突胶质祖细胞增殖分化和“归巢”的特性，将构建的两个神经胶质生长因子基因片段的重组病毒载体进行转染，可高表达这两个神经胶质生长因子，协同发挥神经胶质生长因子的生物学作用和少突胶质祖细胞本身的功能，可以填充损伤的界面、抑制胶质瘢痕形成、重新排列受体组织和延迟轴突生长抑制因子蛋白聚糖的表达，抑制神经二次损伤。其中，所述神经胶质生长因子为生长相关因子43(growth-associated protein-43，GAP-43)和神经胶质生长因子2(glial growth factor 2，GGF-2)；GAP-43表达上调促进神经元生长，抑制胶质瘢痕形成；GGF-2表达升高有助于神经功能恢复，并改善神经炎症反应，控制对神经细胞的损伤作用。两者协同作用，可以填充损伤的界面、抑制胶质瘢痕形成、重新排列受体组织和延迟
轴突生长抑制因子蛋白聚糖的表达，抑制神经二次损伤。本专利技术经我们研发工作中发现了神经胶质生长因子慢病毒载体转染的人少突胶质祖细胞(Oligodendrocyte precursor cells，OPCs)，其稳定表达的神经胶质生长因子能抑制神经二次损伤，而且无成瘤活性。这一研究结果提示了我们可以通过该两个神经胶质生长因子构建慢病毒载体转染人少突胶质祖细胞，使得人少突胶质祖细胞经多次传代培养后仍稳定表达该两个神经胶质生长因子，具有发挥其各自生物学功能的能力。在保证了临床治疗使用的细胞数量的同时，也保持了干细胞很强的增殖、分化、归巢活性，可能在临床治疗中枢神经损伤疾病中发挥着更佳的作用。本专利技术提供了一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体上，共转染人少突胶质祖细胞，制备成可高表达该两个神经胶质生长因子的少突胶质祖细胞，抑制胶质细胞增生造成神经二次损伤促进神经损伤修复；其中，所述神经胶质生长因子为生长相关因子43(GAP-43)和神经胶质生长因子2(GGF-2)。在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了重组GAP-43和GGF-2病毒载体的OPCs传代培养到第10代后，其表达GAP-43和GGF-2基因均高于未转染的第1代OPCs，分别高于至少45和67倍；脊髓损伤大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共转染的OPCs移植后28天BBB(Basso Beattie Bresnahan)运动功能评分改善值为20.00±5.00，皮层体感诱发电位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2-OPCs在治疗脊髓损伤大鼠中，其抑制星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕形成。本专利技术所述人少突胶质祖细胞来源方便，细胞培养获得简单，可以从患者骨髓个体化获得，也可以作为异体规模化生产，能做到个体化应用。人少突胶质祖细胞来源人废弃脐带血、胎盘血、自体骨髓和流产胎脑等，优选地，来源于人自体骨髓。本专利技术所述人少突胶质祖细胞制备方法，即从骨髓经淋巴细胞分离液分离纯化得到的单个核细胞，用无血清少突胶质细胞培养基(即DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、1-50ng/ml成纤维生长因子4，1-100ng/ml干细胞生长因子和1-100ng/ml FMS样酪氨酸激酶
3配体)在10-200μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm2细胞培养瓶中原代和传代培养，获得人少突胶质祖细胞；优选地，无血清少突胶质细胞培养基为DMEM/F12(1∶1)含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、30ng/ml碱性成纤维生长因子、5ng/ml成纤维生长因子4，10ng/ml干细胞生长因子和5ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体；使用50μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm2细胞培养瓶。人少突胶质祖细胞经流式细胞技术检测，OPCs标志物A2B5、O4和Sox10均表达95％以上。本专利技术所述的病毒载体，可以在细胞内稳定增殖和表达目的基因，主要为慢病毒、腺病毒、逆转录病毒等，优选地，选择慢病毒表达系统。本专利技术提供一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，将人GAP-43和GGF-2序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，得到了GAP-43和GGF-2目的片段。将该两个目的DNA片段连接到表达质粒上构建成重组质粒后，经阳性克隆PCR鉴定和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞(OPCs)的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体，包装成病毒后，共转染人少突胶质祖细胞，制备成可高表达该两个神经胶质生长因子的少突胶质祖细胞，其无成瘤活性；其中，所述神经胶质生长因子为生长相关因子43(GAP‑43)和神经胶质生长因子2(GGF‑2)；在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了重组GAP‑43和GGF‑2病毒载体的OPCs传代培养到第10代后，其表达GAP‑43和GGF‑2基因均高于未转染的第1代OPCs，至少分别高45倍和67倍；脊髓损伤大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共转染的OPCs移植后28天BBB(Basso Beattie Bresnahan)运动功能评分改善值为20.00±5.00，皮层体感诱发电位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2‑OPCs在治疗脊髓损伤大鼠中，其抑制星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕形成。

【技术特征摘要】
1.一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞(OPCs)的制备方法，其特征在于，所述方法包括构建两个神经胶质生长因子的病毒表达载体，包装成病毒后，共转染人少突胶质祖细胞，制备成可高表达该两个神经胶质生长因子的少突胶质祖细胞，其无成瘤活性；其中，所述神经胶质生长因子为生长相关因子43(GAP-43)和神经胶质生长因子2(GGF-2)；在通过荧光定量PCR试剂盒按照使用说明书检测，转染了重组GAP-43和GGF-2病毒载体的OPCs传代培养到第10代后，其表达GAP-43和GGF-2基因均高于未转染的第1代OPCs，至少分别高45倍和67倍；脊髓损伤大鼠模型中，GAP43/GGF2病毒共转染的OPCs移植后28天BBB(Basso Beattie Bresnahan)运动功能评分改善值为20.00±5.00，皮层体感诱发电位CSEP波幅改善值6.00±1.00；所述GAP43/GGF2-OPCs在治疗脊髓损伤大鼠中，其抑制星形胶质细胞增殖和胶质瘢痕形成。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过聚合酶链式反应(PCR)技术扩增生长相关因子43和神经胶质生长因子2cDNA序列，分别重组到表达质粒上，经酶切位点连接到病毒表达载体上，两个基因重组病毒载体共转染人少突胶质祖细胞，获得增殖能力增强和分化能力的人少突胶质祖细胞。3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于，所述少突胶质祖细胞来源人废弃脐带血、胎盘血、脐带或自体骨髓体外培养获得的，优选地，来源于人自体骨髓。4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述少突胶质祖细胞制备方法如下：取从20ml骨髓经淋巴细胞分离液分离纯化得到的单个核细胞，用无血清少突胶质细胞培养基重悬到2-5×106/ml，吸取10ml加入到10-200μg/ml多聚赖氨酸包被的75cm2细胞培养瓶中，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养48小时；更换新鲜含细胞因子的无血清少突细胞培养基再连续培养，直到细胞生长融合达到90％，使用质量体积比为0.25％是胰酶进行消化，进行传代培养，即1瓶传代2瓶，补充新鲜含细胞因子的无血清少突细胞培养基继续培养，获
\t得人少突胶质祖细胞；其中，所述细胞培养基优选为DMEM/F12，其含1％N2、2mM L-谷氨酰胺、5-100ng/ml碱性成纤维生长因子、1-50ng/ml成纤维生长因子4、1-100ng/ml干细胞生长因子和1-100ng/ml FMS样酪氨酸激酶3配体；所述胰酶优选含质量体积比为0.02％的EDTA；人少突胶质祖细胞经流式细胞技术检测，OPCs标志物A285、O4和Sox10均表达95％以上。5.一种抑制神经二次损伤的人少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，将人GAP-43和GGF-2序列通过PCR从正常人外周血基因组DNA中扩增下来，将GAP-43和GGF-2目的片段分别和XhoI/Nde I双酶切的pET28a载体片段，在T4DNA连接酶作用下，于4℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合GAP-43和GGF-2大小和序列后，将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的重组质粒放置-80℃超低温冰箱中长期保存；所述GAP-43和GGF-2基因片段大小分别为706bp和1268bp；分别将GAP-43、GGF-2DNA片段和GV358载体进行XhoI/Nde I双酶切，在T4DNA连接酶作用下，将GAP-43片段和酶切GV358载体以及GGF-2片段和酶切GV358载体分别于37℃、12小时连接反应制备克隆连接液，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a后，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定；取细胞状态良好，处于对数生长期的293T细胞，细胞计数后，按照每个10cm的培养皿6×106个细胞数接种于培养皿中，37℃，5％CO2的培养箱中培养过夜；第二天转染前移去培养液，换5ml Opti-MEM培养液；取9μg包装混合液和3μg慢病毒表达质粒加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，取36μl lipofectamine2000加入1.5ml Opti-MEM中，轻轻混匀，室温放置5min；混合质粒溶液和lipofectamine 2000稀释液，置室温20min；混合液缓慢滴加至293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养；培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10ml的PBS液清洗一次，轻柔晃动培养皿以洗涤残余的转染混和物后倒弃；缓慢加入含10％血清的细胞培养基20ml，于37℃、含5％CO2
\t培养箱内继续培养48-72h；根据细胞状态，收集转染后48h的293T细胞上清液；于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数...

【专利技术属性】
技术研发人员：李一民，李一汉，陈宗明，
申请(专利权)人：北京希普生国际生物医学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11