本发明专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种携带Lin28a基因的重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用。将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，获得一携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。本发明专利技术公开的重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑制瘢痕形成。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学领域，具体涉及一种Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用。
技术介绍
目前，各种创伤、烧伤、手术切口的愈合仍然是临床存在的一大难题，尤其是局部放疗伤口的愈合、糖尿病人伤口的愈合、大面积烧伤或褥疮等难愈合伤口的愈合，给患者造成巨大痛苦，也给医疗工作带来巨大负担。创伤修复是个复杂而渐进的过程，而以往的研究基本停留在等待伤口自愈阶段，而缺乏促进创伤修复的积极措施。Lin28是存在于高等真核生物中的一种保守RNA结合蛋白，它是可以将人类体细胞重新编程为多潜能干细胞的四种多能性因子之一，在调节细胞生长分化、新陈代谢以及细胞多能性等方面起重要作用。在哺乳动物基因组中，存在两个同源基因Lin28a与Lin28b，两者序列相似度高达76%。Lin28a与Lin28b虽然在核酸序列上具有极高的相似性，但其在细胞中的定位及具体功能却有差异。在人类基因组中Lin28a定位于染色体1p36.11，蛋白质编码区含有209个氨基酸残基，其同源蛋白基因Lin28b定位于染色体6p21，编码一个含有250个氨基酸残基的小分子蛋白质。由于Lin28a与Lin28b在功能上存在一定的差异，导致表达细胞的类型也具有一定的特异性：Lin28b与多种癌症的触发、转移相关，并在多种癌细胞系中呈现出高表达状态，提示其可能成为癌症发生预测的标志性分子；Lin28a的主要功能是调控细胞的分化过程，因此广泛表达于胚胎干细胞与早期胚胎形成时的细胞中，Lin28a基因可通过调控糖酵解和氧化磷酸化反应加强葡萄糖氧化代谢，能激活胶原蛋白，新生的胶原蛋白能重新建立起胶原支架，提示Lin28a基因具有促进创伤修复能力。腺相关病毒（AAV）是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒。近年来用AAV作基因转移载体已成为基因治疗研究的热点。这是由于AAV具有以下特点：（1）安全性好：迄今从未发现野生型AAV对人体致病；重组AAV去除了野生型AAV基因组的96%，进一步保证了安全性；（2）宿主范围广：不仅可转导分裂细胞，而且可转导静止期细胞；（3）野生型AAV可整合到人基因组19号染色体q臂的特定位置，利用这一特点，有可能研制出具有特异性整合功能的AAV载体；（4）AAV-2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作；（5）物理性质稳定：在60°C不能被灭活，能抗氯仿；（6）重组AAV（rAAV）可长期稳定地表达外源基因。腺相关病毒对许多哺乳动物细胞都比较易感，能够转染的细胞种类也比较多，无论是细胞系，还是原代培养的贴壁细胞，亦或是常规转染试剂难以转染的细胞类型，腺相关病毒都有很好的转染效率，与质粒转染相比，具有瞬时转染基因转移效率更高的优点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供携带Lin28a基因的重组腺相关病毒（AAV-Lin28a），将Lin28a基因构建入腺相关病毒载体，用于Lin28a基因的过表达，该AAV-Lin28a能促进创伤修复。本专利技术提供的Lin28a基因过表达腺相关病毒在促进创伤修复中的应用，通过以下技术方案来实现：1.人工合成Lin28a全基因组；2.将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，利用pHelper质粒包装系统共转染细胞，获得重组腺相关病毒AAV-Lin28a，进一步得到病毒浓缩液；3.建立皮肤表面创伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进皮肤创伤愈合；4.建立度烧伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进深度烧伤的真皮再生，并能抑制皮肤瘢痕形成；5.建立骨损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进骨损伤修复；6.建立软组织损伤动物模型和合适的基因转移方法，证明AAV-Lin28a可促进软组织损伤修复。本专利技术的有益效果在于：本专利技术将Lin28a基因插入到腺相关病毒载体上，获得一携带Lin28a基因的重组腺相关病毒。该重组腺相关病毒制备方法简单，能有效促进皮肤创伤的愈合，能显著促进部分深度烧伤的真皮再生，能促进骨损伤和软组织损伤修复，并能抑制瘢痕形成。附图说明附图1为三组动物皮肤创伤愈合率的变化趋势图。附图2为皮肤HE染色效果图（A：AAV-Lin28a；B：AAV-MCS；C：PBS）。具体实施方式下面给出实施例以对本专利技术作更详细的说明，有必要指出的是以下实施例不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述本
技术实现思路
对本专利技术作出的一些非本质的改进和调整仍属本专利技术的保护范围。实施例实施例1重组腺相关病毒的制备。构建重组腺相关病毒载体。由上海生物工程有限公司全基因合成Lin28a基因，构建到pUC57载体中，得到pUC57-Lin28a质粒（测序结果见SEQIDNO.1）。采用限制性内切酶EcoRI和BamHI（购自Takara公司）双酶切pUC57-Lin28a和pAAV-MCS腺相关病毒载体(购自Stratagene公司)，酶切体系为：pAAV-MCS/pUC57-Lin28a质粒：10ul，EcoRI：3ul，BamHI：3ul，buffer：4ul，H2O：20ul。37℃水浴30min，琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，回收Lin28a基因片段和pAAV-MCS载体骨架（操作步骤参照Takara琼脂糖核酸纯化回收试剂盒说明书）。将Lin28a基因插入酶切回收pAAV-MCS载体中（具体步骤参照Takara公司DNALigationKitVer.2.1试剂盒说明书），连接体系为：Lin28a回收产物：2.5ul，pAAV-MCS回收产物：2.5ul，SolutionI：5ul。16℃孵育30min，取连接产物10ul加入100ulDH5α感受态细胞（购自Takara公司）中吹打均匀，冰上静置20min，再放入42℃水浴90s，迅速置于冰中，静置3min，加入500ulLB液体培养基，180rpm、37℃振荡培养1h，取菌液100ul均匀涂布于LB固体培养基（含1/1000氨苄青霉素），37℃培养过夜。挑取单克隆菌落于5mlLB培养基（含1/1000氨苄青霉素）中，180rpm37℃培养12h后提取质粒（操作步骤参照Takara质粒提取试剂盒说明书）。取样送至上海生物工程有限公司测序验证确认正确。将构建的质粒命名为pAAV-Lin28a。细胞株293FT的复苏与培养。取液氮冻存的293FT细胞株（购自Clontech公司），迅速放于37℃水浴中解冻，期间...
【技术保护点】
重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用，其中所述重组腺相关病毒携带Lin28a基因。
【技术特征摘要】
1.重组腺相关病毒在制备用于促进创伤修复药物中的应用，其中所述重组腺相关病毒
携带Lin28a基因。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进皮肤创伤愈合。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物用于促进深度烧...
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，申友锋，
申请(专利权)人：重庆高圣生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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