人类附睾表达精子结合蛋白ＨＥＬ－２１５及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术和医学领域。本发明专利技术公开了一种新的人附睾特异表达精子结合蛋白ＨＥＬ－２１５及其制备和应用。公开了本发明专利技术编码ＨＥＬ－２１５蛋白的氨基酸序列，提供携带编码本发明专利技术蛋白的ＤＮＡ序列的重组表达载体。该蛋白定位于成熟精子头后部及颈部区域，在附睾头和体部表达量较高，用Ｗｅｓｔｅｒｎ？ｂｌｏｔ在附睾检测到一条１６ＫＤ左右条带。ＨＥＬ－２１５蛋白可作为免疫性避孕药的研发，以及男性不育症的临床诊断与治疗的靶蛋白。基于ＨＥＬ－２１５蛋白开发的相应基因或蛋白检测方法，将广泛用于生殖医学研究领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术与医学领域。具体地说，本专利技术涉及一种新的人类附睾表达 蛋白HEL-215及其编码基因与应用
技术介绍
本世纪人类的发展面临着两个严峻的问题一方面，全球人口在急速膨胀，预计在 2050年将达到90亿；另一方面，据世界卫生组织调查，大约15%的夫妇存在着不育问题，发 达国家不育症的发病率在最近IO年飚升，欧洲发达国家可高达30%，其中男性因素约占一 半。世界卫生组织预测，随着环境污染和性传播疾病等致病因素的增加，本世纪，不育症将 成为仅次于肿瘤和心脑血管病的第三大疾病。但男性不育并未引起社会和医学界的足够重 视，因此有关男性生殖健康的研究进展缓慢，明显落后于其它学科。缺少分子生物学层面诊 断与治疗不育症的有效方法。由于精子发育障碍不能自然受精，需要医生通过做试管婴儿 获取后代。利用此种技术获取后代，不仅耗费了宝贵的时间与资金，而且存在很多影响健康 的潜在因素，失去了正常生育过程中精卵天然结合、优势选择遗传后代的机会。给家庭与社 会带来了沉重的精神和经济负担。 全世界人口的急剧增长造成了资源耗竭和环境恶化，成为人类健康与生存的严重 威胁。当前世界人口已超过60亿，据专家估计，中国资源环境能支撑的最大人口容量为 15-16亿。目前可供人类选择的避孕措施还很有限，离高效、安全、可逆的标准还相差较 远。发展安全有效、先进实用的避孕节育新技术、新产品，以满足不同人群、不同层次的避孕 用药的个性化要求是近年来国内外避孕节育技术发展的总趋势。 附睾是精子成熟的重要器官，睾丸产生的精子需要通过与附睾管腔微环境相互作 用才能获得运动、受精、防御和维持正常胚胎发育以及防御等生物学功能。附睾内大约有 200余种分泌蛋白与精子相互作用，参与精子成熟过程，但是人们对这些蛋白的功能知之甚 少。与精子成熟相关的附睾蛋白的研究将有助于推动男性生殖医学的研究进展，为男性不 育症的诊断和治疗以及开发新型避孕药物提供侯选分子靶标，同时有可能对附睾环节的男 性避孕带来新的思路和突破。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种新的人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215。 —种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215，它具有序列表中序列2的氨基酸序列 或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序 列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质或多肽。 本专利技术的人附睾分泌蛋白命名为HEL-215，由156个氨基酸残基组成。HEL-215蛋 白存在有1个N糖基化位点，1个N-十四烷酰基化位点、1个酪蛋白激酶II磷酸化位点和 1个蛋白激酶C磷酸化位点。 本专利技术的第二个目的是提供编码人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215的基因。它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的DNA序列，GenBank注册号为FJ237363 ; 编码序列表中SEQ ID No. 2蛋白质序列的多核苷酸； 与序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA序列。 序列表中的SEQID No. l，全长c D N A序列为1607bp，定位于人14号染色体上， 编码156个氨基酸，编码蛋白为HEL-215，含有信号肽，其开放阅读框为471bp，是一个完整 的读码框。 本专利技术的第三方面，提供了采用基因工程技术制备具有人类附睾表达精子结合蛋 白HEL-215活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的载体，以及被该载体转化或 转导的宿主细胞。 本专利技术的第四方面，提供了与上述人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215特异性结合的抗体，以及由此开发的用于附睾功能异常所致的不育症的辅助诊断。 本专利技术的第五方面，提供了检测样本中是否存在人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215的方法，它包括将待测样品与分泌蛋白的特异性抗体在一定条件下共同作用，观察是否形成抗原抗体复合物，有抗原抗体复合物形成就提示样品中存在分泌蛋白。 本专利技术的第六方面，提供了本专利技术蛋白和其编码序列的用途。例如本专利技术蛋白可被作为诊断不育症的分子靶点，或作为有效药物成分用于治疗不育症，或作为开发新型避孕药物的靶分子，或被用于筛选促进人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215活性的激动剂，或被用于筛选抑制人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215活性的拮抗剂，或被用于肽指纹图谱鉴定。根据人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215的编码序列或其片段，可设计引物或探针用于PCR或核酸杂交，或者用于制备基因芯片。本专利技术蛋白还可用于药物组合物，以此作为有效活性成分，用于生产一种对抗病原微生物感染以及肿瘤等疾病的药物。 本专利技术的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含本专利技术所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞，以及药学上可接受的载体。 本专利技术的蛋白能够在附睾内特异性表达，定位于精子头后部及颈部区域，因此可 能与精卵识别有关。因为它是一种天然的蛋白多肽，可以预见可能具有较少的副作用，本发 明的其他优点可从以下的详细描述获知。附图说明 图.1 HEL-215蛋白在人精子上的免疫荧光定位 红色荧光显示精子核；绿色荧光显示HEL-215蛋白在精子上的定位； A组阳性对照，A3显示HEL-75蛋白结合于整个精子(文章已发表)； B组阴性对照。 C组HEL_215蛋白定位，C3.显示HEL-215蛋白结合在精子头后部及颈部区域。 比例尺5mm。 图2 HEL-215基因组织表达图谱 l附睾头2附睾体3附睾尾4睾丸5心6肝7脾8肾9胃10阴性 对照4 图3. HEL-215蛋白在附睾液表达的western blot结果 M -Marker ;1 :阳性对照，HEL-75蛋白；2 :阴性对照，小鼠血清;3 :HEL_215蛋白 本专利技术的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的变异 形式，这些变异形式包括(但并不限于)相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为 1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和取代。另 外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地 为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置换表是 本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了蛋白的片段或衍生物，条件是该片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。 本专利技术的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对 于PCR扩增法，可根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引 物，用本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。 这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得 到有关序列。 本专利技术中，使用本领域技术人员已知的常规方法将包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类附睾表达精子结合蛋白ＨＥＬ－２１５，其特征在于，它具有序列表中序列２的氨基酸序列或将序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列２的氨基酸残基序列相同活性的序列２衍生的蛋白质和通过化学方法合成的蛋白质。

【技术特征摘要】
一种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的序列2衍生的蛋白质和通过化学方法合成的蛋白质。2. —种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-215的编码基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；与序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA 序列。3. 含有权利要求2所述基因的真核和原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建远，
申请(专利权)人：李建远，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]