人类附睾表达精子结合蛋白ＨＥＬ－１２２及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术和医学领域。本发明专利技术公开了一种新的人附睾特异表达精子结合蛋白ＨＥＬ－１２２及其制备和应用。公开了本发明专利技术编码ＨＥＬ－１２２蛋白的氨基酸序列，提供携带编码本发明专利技术蛋白的ＤＮＡ序列的重组表达载体。本发明专利技术还公开了该蛋白的制备和检测ＨＥＬ－１２２蛋白生物学功能的方法。这种蛋白是附睾特异表达的，且在附睾体部表达量最高，并结合在精子赤道；对精子受精发挥重要作用。ＨＥＬ－１２２蛋白可作为免疫性避孕药的研发，以及男性不育症的临床诊断与治疗的靶蛋白。基于ＨＥＬ－１２２蛋白开发的相应基因或蛋白检测方法，将广泛用于生殖医学研究领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术和医学领域。本专利技术提供一种新的人附睾特异表达精子结合 蛋白HEL-122,公开了编码HEL-122蛋白的氨基酸序列和编码本蛋白的DNA序列。本专利技术还 公开了该蛋白的制备和检测方法，以及生物学功能。该蛋白对精子成熟、正常受精及早期胚 胎发育发挥重要作用。HEL-122蛋白可作为免疫性避孕药的研发，以及男性不育症的临床诊 断与治疗的靶蛋白。该蛋白的研发，对男性生殖医学意义重大。
技术介绍
免疫性避孕作为一种可逆的非激素疗法已经研究了多年，并且研究重点是通过女 性免疫来阻止怀孕或受精，而对于男性免疫避孕的研究却很少。近年来，许多附睾蛋白酶 抑制剂相继被报道，其在宿主天然防御及男性免疫避孕等方面发挥重要作用。0' Rand等 (Science, 2001)报道附睾蛋白酶抑制剂EPPIN，其在人附睾和睾丸中特异表达，成功地使 雄性灵长类免疫避孕。研究附睾蛋白酶抑制剂在精子成熟和受精过程中发挥的重要作用， 开发安全、有效的雄性灵长类免疫避孕疫苗是可实现的。 蛋白酶抑制剂广泛存在于生物体内，在许多生命活动过程中发挥必不可少的作 用，特别是对蛋白酶活性进行精确调控。附睾蛋白酶抑制剂作为附睾管腔分泌蛋白的主要 成分(Penttinenjetal. ，2003 ;ZhouCXet al. ，2004)在睾丸精子进入附睾后的进一步成熟 过程中发挥重要调控作用。精子在附睾中的成熟需要管腔离子浓度的改变及一些糖苷酶和 蛋白酶对精子膜表面的修饰来调控，而这些蛋白酶需要相应的蛋白酶抑制剂调节并达到平 衡(B.Robaire et al.，2000 ;N. D. Rawlings et al. ， 2004 ; J. L. Dacheux et al.，2005)。研 究附睾蛋白酶抑制剂这类重要的附睾基因，如何参与主要附睾功能调控和精子成熟的机制 具有重要意义(J.Potempaet al. ， 1994)。到目前为止，有关附睾蛋白酶抑制剂重组蛋白生 物学功能的研究仍不多见。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种新的人类附睾表达精子结合蛋白HEL_122。 —种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122,它具有序列表中序列2的氨基酸序列 或将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序 列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质或多肽。 本专利技术的人附睾分泌蛋白命名为HEL-122，在NVTA(55-58aa)处预测存在一个糖 基化位点。与KAZAL型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族其他成员相比，人附睾HEL-122蛋白也含 有6个保守的半胱氨酸残基，并具有一典型KAZAL结构域(47-93aa)。其氨基酸序列与黑猩 猩相比有97. 9 %同源性，与褐鼠有53. 8 %同源性。 本专利技术的第二个目的是提供编码人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122的基因。它 是下列核苷酸序列之一序列表中序列1的DNA序歹lj， GenBank注册号为EF426754 ; 编码序列表中SEQ ID No. 2蛋白质序列的多核苷酸； 与序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白质 的DNA序列。 序列表中的SEQ ID No. l，全长c DNA序列为1022bp，定位于人5q33. 1号染色体 上，编码94个氨基酸，编码蛋白为HEL-122,含有信号肽，其开放阅读框为285bp，是一个完 整的读码框。 本专利技术的第三方面，提供了采用基因工程技术制备具有人类附睾表达蛋白 HEL-122活性多肽的方法，它包括含有上述多核苷酸序列的载体，以及被该载体转化或转导 的宿主细胞。 本专利技术的第四方面，提供了与上述人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122特异性结合的抗体，以及由此开发的用于附睾功能异常所致的不育症的辅助诊断。 本专利技术的第五方面，提供了检测样本中是否存在人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122的方法，它包括将待测样品与分泌蛋白的特异性抗体在一定条件下共同作用，观察是否形成抗原抗体复合物，有抗原抗体复合物形成就提示样品中存在分泌蛋白。 本专利技术的第六方面，提供了本专利技术蛋白和其编码序列的用途。例如本专利技术蛋白可被作为诊断不育症的分子靶点，或作为有效药物成分用于治疗不育症，或作为开发新型避孕药物的靶分子，或被用于筛选促进人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122活性的激动剂拮抗剂，或被用于肽指纹图谱鉴定。根据人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122的编码序列或其片段，可设计引物或探针用于PCR或核酸杂交，或者用于制备基因芯片。 本专利技术的第七方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包含本专利技术所述的蛋白、核苷酸序列、构建物或细胞，以及药学上可接受的载体。 本专利技术的蛋白能够在附睾内特异性表达，而且所述蛋白表现蛋白酶抑活性，定位 于精子赤道区，因此可能与代谢及生殖有关。因为它是一种天然的蛋白多肽，可以预见可能 具有较少的副作用，本专利技术的其他优点可从以下的详细描述获知。附图说明 图1. HEL-122蛋白在人精子上的免疫荧光定位 红色荧光显示精子核；绿色荧光显示HEL-122蛋白在精子上的定位； A组阳性对照，A3显示HEL-75蛋白结合于整个精子(文章已发表)； B组阴性对照。 C组HEL_122蛋白定位，C3.显示HEL-122蛋白结合在精子赤道区域。 比例尺5mm。 图2 HEL-78基因组织表达图谱 l附睾头2附睾体3附睾尾4睾丸5心6肝7脾8肾9胃10阴性 对照 图3. HEL-122蛋白在附睾液表达的western blot结果 M -Marker ;1 :阳性对照，HEL-75蛋白；2 :阴性对照，小鼠血清;3 :HEL_122蛋白 本专利技术的蛋白包括了所述蛋白多肽的具有相同或相似性生物活性或功能的变异 形式，这些变异形式包括(但并不限于)相对于天然蛋白的氨基酸序列有若干个(通常为41-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳的1-10个)氨基酸的缺失、插入和取代。另 外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地 为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)，在本领域中，用性能相近或相似的 氨基酸进行取代时，通常不会改变氨基酸的功能，提供功能相似氨基酸的保守性置换表是 本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸；脂族甘氨酸(G)、丙氨酸 (A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I);芳族苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性天冬氨酸(D)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了蛋白的片段或衍生物，条件是该片段或衍生物保留了所希望的蛋白生物活性。 本专利技术的核苷酸序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对 于PCR扩增法，可根据本专利技术所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引 物，用本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA文库作为模板，扩增而得有关序列。 这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得 到有关序列。 本专利技术中，使用本领域技术人员已知的常规方法将包含编码本专利技术的蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人类附睾表达精子结合蛋白ＨＥＬ－１２２，其特征在于，它具有序列表中序列２的氨基酸序列或将序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列２的氨基酸残基序列相同活性的序列２衍生的蛋白质和通过化学方法合成的蛋白质。

【技术特征摘要】
一种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122，其特征在于，它具有序列表中序列2的氨基酸序列或将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的序列2衍生的蛋白质和通过化学方法合成的蛋白质。2. —种人类附睾表达精子结合蛋白HEL-122的编码基因，它是下列核苷酸序列之一 序列表中序列1的核苷酸序列；与序列表中序列1限定的DNA序列具有90X以上同源性，且编码相同功能蛋白的DNA序列。3. 含有权利要求2所述基因的真核和原...

【专利技术属性】
技术研发人员：李建远，
申请(专利权)人：李建远，
类型：发明
国别省市：37[中国|山东]