诱导植物开花的HD3A基因及其应用制造技术

本发明专利技术通过连锁分析，成功地分离出Ｈｄ３ａ基因。本发明专利技术发现植物的开花时间可通过引入Ｈｄ３ａ基因或通过控制其表达来调整。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及诱导植物开花的基因，以及用这些基因改变植物的开花时间的方法。改变植物的开花时间的方法对植物品种改良十分有用。
技术介绍
一般情况下，水稻的抽穗(开花)在短昼(short-day)时提前而长昼(1ong-day)时延迟。在已知的栽培品种中，通常是那些来自九州岛和日本大陆南部的品种具有较强的光周期敏感性，而来自东北地区或北海道的品种完全丧失了这种敏感性或光周期敏感性很低。缺乏光周期敏感性的水稻在特定的生长期后有特征性的开花，该植物的抽穗期不随光周期的改变而变化。水稻植物对栽培地点和时间的适应性根据该植物中光周期敏感性的存在而彻底不同。因此，改变水稻的光周期敏感性对于水稻品种改良十分重要。在常规品种改良项目中，水稻抽穗期通过涉及以下方面的方法来改变(1)通过杂交选择早熟品种或晚熟品种；和(2)通过辐射和化学试剂进行诱变；等。但是，这类品种改良项目的成功需要较长时间，并存在其它问题，如不能预计后代中突变的程度或方向。“光周期敏感性基因”是在水稻遗传学领域中能提高水稻的光周期敏感性的基因的一般性名称。已发现多个光周期敏感性基因的存在在突变体和栽培品种中是固有的，还提示光周期敏感性基因存在于，例如，Sel基因座(6号染色体；Yokoo和Fujimaki(1971)Japan.J.Breed.2135-39)，E1基因座(7号染色体；Tsai，K.H.(1976)Jpn.J.genet.51115-128；Okumoto，Y.et a1.(1992)Jpn.J.Breed.42415-429)，E2基因座(未知)，E3基因座(3号染色体)；Okumoto et al.Japanese Society of Breeding，91st lecture，Japanese Journal ofBreeding 47(Suppl.1)31)；和其它类似基因座(Yamagata et al.(1986)In Ricegenetics，International Rice Research Institute，Manilla，pp351-359)。当分离出水稻的光周期敏感性基因或由光周期敏感性基因控制的调节水稻抽穗的基因，通过转化方法将该基因引入任意目标水稻品种，将使控制水稻品种的抽穗时间成为可能。此外，不同植物的开花时间可以利用其它植物中对应于这种水稻光周期敏感性基因的基因进行控制。这种育种方法在方便性和可靠性方面与传统方法相比较具有极大优势。
技术实现思路
本专利技术是针对上述情况做出的。本专利技术的目的是提供新的控制植物开花基因。此外，本专利技术另一目的是用这些基因调节植物的开花时间。本专利技术人特别关注于极需开发能改变其抽穗期(开花期)的简便方法的那些水稻，并积极地分离与水稻抽穗相关的基因。在水稻中，用Nipponbare和Kasalath的杂交后代检测一种量化特性座位(QTL)Hd3a，发现它位于6号染色体的短臂上。此外，用具有Nipponbare遗传背景的Hd3a区(Kasalath的等位基因)近似纯合系进行的分析揭示，Hd3a基因座与短日照条件下促进抽穗的光周期敏感性基因座相同。为了分离已知其存在但未鉴定出的光周期敏感性基因Hd3a，本专利技术人首先用P1衍生的人工染色体(PAC)克隆通过连锁分析对Hd3a基因区进行作图。具体地，用基于作图而进行的克隆所必需的大隔离群对Hd3a区进行了连锁分析。首先，使用Hd3a区的隔离群体和限制性片段长度多态性(RFLP)标记物建立连锁图谱，经证实Hd3a位于RELP标记物C764和B174之间的间隔区中(Monna等，the 1999 Annual Meeting of Japanese Society of MolecularBiology)。另外，利用Hd3a两侧的切割扩增多态性序列(CAPS)标记物CP13和CP15，从具有Hd3a区、拟利用子代分析确定其基因型的隔离群体，选出了在染色体上Hd3a的邻接区发生了重组的植株。经鉴定有8个个体在Hd3a和CP13之间发生重组，有2个在Hd3a和CP15之间发生重组。然后，本专利技术人利用P1衍生的人工染色体(PAC)克隆对Hd3a基因区进行对比排列。更具体地，从Nipponbare PAC基因组文库选出了3种PAC克隆，它们在Hd3a基因座的邻接区内具有DNA标记物的序列。P0046E09和P0698G05克隆带有位于Hd3a两侧的标记物CP13和CP15的核苷酸序列，从而揭示了这些PAC克隆包含所述Hd3a基因区(图1)。对PAC克隆P0046E09的核苷酸序列分析发现，候选基因组区限定在一个约20kb的区域内。针对该候选区的核苷酸序列进行基因预测和同源性搜索，检测出以下区域，它们显示了与脂转移蛋白的基因，酰基-CoA合成酶基因，和拟南芥的FT基因具有高度同源性。然后，用Nipponbare和近似纯合系(NIL(Hd3a))以RT-PCR分析这些候选基因的表达，该近似纯合系的Hd3a基因区被Kasalath染色体节段取代。结果证实了全部三种基因的表达，并发现在短日照条件下FT-样基因的转录水平增加(图2)。因此，选择FT-样基因作为潜在的候选基因。从Kasalath基因组DNA建立粘粒文库。从粘粒文库筛选与FT-样基因区相应的克隆(图1)，并分析FT-样基因区的核苷酸序列。结果发现与Nipponbare的核苷酸序列相比，Kasalath的核苷酸序列中有41个位点发生突变(核苷酸的插入，缺失和取代)(图3)。外显子内的核苷酸取代导致一个氨基酸取代由天冬酰胺(Kasalath)变成脯氨酸(Nipponbare)(图3)。接着，本专利技术人将仅含Kasalath或Nipponbare候选基因区的片段引入一种可转化载体，来转化水稻植物，并分析所得转化体的表型。结果，在引入了这些基因的植物中，发现在短日照条件和长日照条件下都能提前抽穗的植株。但在仅引入了载体的植物中未发现抽穗时间的明显改变(表1)。另还对短日照条件下提前抽穗的转化植物的自花授粉后代进行培育，检查从播种到抽穗所需天数(抽穗期)的差异。结果隔离出比对照植株提早抽穗的植株，所有提早抽穗的植物都含有引入的基因(图4)。类似地，在长日照条件下，对照植物不能达到抽穗阶段，但在上述自花授粉后代中却发现了抽穗植物，它们全部都保留了引入的片段(图4)。上述结果证实，候选的FT-样基因具有促进水稻抽穗(开花)的功能，结论是这种候选的FT-样基因是Hd3a基因。Hd3a基因广泛分布在植物中，有观点认为它与诱导这些植物开花有关。最后，本专利技术人成功地分离出能诱导植物开花的Hd3a基因。本专利技术人还发现，植物的开花时间可利用这种基因进行改变，因此完成本专利技术。更具体地，本专利技术提供了(1)一种编码植物蛋白的DNA，所述蛋白可诱导植物开花，所述DNA选自(a)编码含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列的蛋白的DNA；(b)编码含有SEQ ID NO2或4的氨基酸序列，但其中一或多个氨基酸已被取代、缺失、添加和/或插入的蛋白的DNA；和(c)能在严谨条件下与由SEQ ID NO1，3，23或24的核苷酸序列组成的DNA杂交的DNA。(2)(1)的DNA，其中该DNA来自水稻。(3)一种DNA，其编码与(1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码植物蛋白的ＤＮＡ，所述蛋白可诱导植物开花，所述ＤＮＡ选自：（ａ）编码含有ＳＥＱＩＤＮＯ：２或４所示氨基酸序列的蛋白的ＤＮＡ；（ｂ）编码含有ＳＥＱＩＤＮＯ：２或４所示氨基酸序列，但其中一或多个氨基酸已被 取代、缺失、添加和／或插入的蛋白的ＤＮＡ；和（ｃ）能在严谨条件下与由ＳＥＱＩＤＮＯ：１，３，２３或２４所示核苷酸序列组成的ＤＮＡ杂交的ＤＮＡ。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：矢野昌裕，小岛晶子，
申请(专利权)人：独立行政法人农业生物资源研究所，生物系特定产业技术研究推进机构，
类型：发明
国别省市：JP[日本]