本发明专利技术公开了一种启动子，该启动子的长度为150-1000bp，其中，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录。本发明专利技术还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，所述重组表达载体中的启动子包括如上所述的启动子。本发明专利技术还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒。本发明专利技术还提供了如上所述的启动子在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。通过上述技术方案，本发明专利技术在不进行诱导的条件下显著地提高了外源蛋白的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体地，涉及一种启动子、一种重组表达载体、一种表 达外源蛋白的方法和该启动子的用途。
技术介绍
启动子是一段位于结构基因5'端上游区的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之与 模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性。因为基因的特异性转录取决于酶与启动 子能否有效地形成二元复合物，故RNA聚合酶如何有效地找到启动子并与之相结合是转录 起始过程中首先要解决的问题。有实验表明，对许多启动子来说，RNA聚合酶与之相结合的 速率至少比布朗运动中的随机碰撞高100倍。 不同的启动子的转录活性差别较大，其中，转录活性较强的启动子在基因工程中 具有非常重要的应用价值。例如，在枯草芽孢杆菌中经常用到的P43组成型启动子和淀粉 诱导启动子。这些启动子可以用于构建用于表达外源蛋白的表达载体。携带这些启动子的 表达载体上能够插入编码外源蛋白的阅读框，从而形成用于表达外源蛋白的表达质粒。启 动子的转录活性的强弱，能够显著地影响外源蛋白在宿主中的表达量。 枯草芽孢杆菌作为一种重要的工业微生物，是目前生产各种工业蛋白酶的理想表 达宿主。强而可控的启动子是外源蛋白高效表达的关键因素之一，稳定期特异性高效表达 启动子相较于常用的依赖诱导物的诱导型启动子而言，更适合工业化大规模生产。但是，上 面提到的P43启动子的转录活性较低，而淀粉诱导启动子需要额外添加淀粉作为诱导物， 存在操作复杂成本过高的缺陷。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有的不需要诱导的启动子转录活性较低的缺陷，提供一种 不需要诱导但转录活性较高的启动子。 为了实现上述目的，本专利技术提供了一种启动子，该启动子的长度为150-1000bp，其 特征在于，所述启动子具有如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯 草芽孢杆菌中的转录。 本专利技术还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所 插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，所述重组表达载体中的启动子包括如上所述的启动 子。 本专利技术还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋 白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入 感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。 本专利技术还提供了如上所述的启动子在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用 途。 通过上述技术方案，本专利技术在不进行诱导的条件下显著地提高了外源蛋白的表达 量。 本专利技术的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。【附图说明】 附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中： 图1是启动子重组载体R)-bgaB :pUBC19的结构示意图。 图2是使用R)启动子的菌株和使用P43启动子的菌株提取菌体蛋白并进行电泳 的电泳图，泳道1为使用P43启动子的菌株的菌体蛋白电泳结果，泳道2为使用R)启动子 的菌株的菌体蛋白电泳结果。【具体实施方式】 以下结合附图对本专利技术的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。 本专利技术提供了一种启动子，该启动子的长度为150-1000bp，其特征在于，所述启动 子具有如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转 录。 在本专利技术中，在未作相反说明的情况下，使用的术语"启动子"是指位于结构基因 5'端上游的能被RNA聚合酶特异性识别并活化RNA聚合酶的DNA序列。本专利技术中，启动子 是指原核生物的启动子。其中，如SEQ ID NO. 1所示的核酸片段的长度为121bp，是启动子 的核心片段，具有该核心片段是核酸能够具有启动子功能的必要条件，其本身也可以作为 启动子；也可以在该核心片段的5'端进行适当的延长直至达到150-1000bp的长度，只要延 长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。 其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段。其中，如SEQ ID NO. 2所示的核酸片段长度为197bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO. 2 所示的核酸片段的5'端进行适当的延长直至达到200-1000bp的长度，只要延长后得到的 核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。 其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段。其中，如SEQ ID NO. 3所示的核酸片段长度为276bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO. 3 所示的核酸片段的5'端进行适当的延长直至达到280-1000bp的长度，只要延长后得到的 核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。 其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段。其中，如SEQ ID NO. 4所示的核酸片段长度为424bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO. 4 所示的核酸片段的5'端进行适当的延长直至达到430-1000bp的长度，只要延长后得到的 核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。 其中，优选地，所述启动子具有如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段。其中，如SEQ ID NO. 5所示的核酸片段长度为619bp，其本身也可以作为启动子使用；也可以在SEQ ID NO. 5 所示的核酸片段的5'端进行适当的延长直至达到620-1000bp的长度，只要延长后得到的 核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。 本专利技术还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所 插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，其中，所述重组表达载体中的启动子包括如上所述 的启动子。 其中，待表达的蛋白质的阅读框序列可以通过查询或测序的方式确定，待表达的 蛋白质的阅读框的DNA可以通过常规的分子生物学手段获得，例如全序列合成、PCR扩增和 限制性酶切。通常地，所述重组表达载体上可以具有一些常规的元件，例如复制起始点、筛 选基因、多克隆位点和转录终止信号等。 其中，优选地，所述重组表达载体具有如SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6或SEQ ID NO. 7所示的序列。 本专利技术还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋 白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入 感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。 其中，所述感受态细菌可以为常规使用的各种生物工程用的细菌，例如枯草芽孢 杆菌、大肠杆菌、解淀粉芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌中的至少一种，优选地，所述感受态细 菌为枯草芽孢杆菌。 其中，本专利技术的启动子在细菌培养生长的对数期晚期和平台期时能够具有更高的 转录活性，因此特别优选地，上述表达外源蛋白的方法包括：培养所述表达菌株至对数期晚 期或平台期。 本专利技术还提供了如上所述的启动子在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用 途。可以将已有的重组表达载体和/或表达质粒中的启动子中的一个或多个用常规的基因 工程手段（例如限制性酶切和/或PCR的方式）替换为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种启动子，该启动子的长度为150‑1000bp，其特征在于，所述启动子具有如SEQ ID NO.1所示的核酸片段，并且所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：田健，伍宁丰，余小霞，刘晓青，初晓宇，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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