赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及应用，属于生物技术领域。LRK2基因是从陆地棉品种奥3503品种中获得的一个表面受体蛋白基因，LRK2完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。LRK2转基因拟南芥对落叶型黄萎病菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗病性明显增强，转基因拟南芥发病率均低于20%，而对照野生型发病率均大于50%。

【技术实现步骤摘要】
一、
本专利技术提供了一个赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因及应用，属于植物基因工程领域。用于通过植物基因工程技术改善植物抗病性和其他有益生产性状。二、
技术介绍
目前，生产上黄萎病危害十分严重，是棉花、番茄、辣椒、茄子等植物的主要真菌病害，造成减产甚至绝收，尚无有效的防治措施。黄萎病的病原主要为大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)，以微菌核(microsclerotia)形式长期存在于土壤中。黄萎病菌在寄主植物上会表现出致病性差异，在与寄主相互作用、协同进化及生态环境差异的影响下，常产生生理分化，出现新的致病类型。张天真等用RAPD指纹图谱聚类分析将我国棉花黄萎病菌株划分为8类，但是同一类中可能同时含有强中弱致病菌，说明黄萎病致病机制十分复杂(张天真,2000)。另外，由转座子和DNA水平转移等引起黄萎病菌的遗传变异也限制了棉花抗黄萎病育种(AmyotteSG，etal.,2012；deJonge,etal.,2012)。因此，克隆抗性基因、解析抗病机制对抗黄萎病育种意义重大而迫切。然而，目前对黄萎病具有抗性的基因较少，尤其对棉花黄萎病具有稳定广谱高抗的基因未见报道。Fradin等(2011)将番茄中Ve1转化拟南芥，获得了对黄萎病菌的抗性，而该基因转化烟草和棉花后，不具有黄萎病抗性，表明该基因在植物上的应用具有物种特异性(刘琳琳等，棉花与番茄抗棉花黄萎病不依赖于Ve1，中国科学:生命科学，2014(44)卷第8<br>期:803-814)。从抗黄萎病海岛棉品种H7124中克隆了与番茄Ve1基因(Fradinetal.,2009)和棉花GbVe基因(Zhangetal.,2011)部分同源的Gbve1基因，该基因也具有典型的植物抗病蛋白结构域，利用VIGS沉默Gbve1基因可使海岛棉H7124对黄萎病的抗性丧失；并且，Gbve1基因转化拟南芥和陆地棉的结果都表明Gbve1基因对强致病力的落叶型和非落叶型黄萎病菌都具有抗性(Zhangetal.,2012a)，但是并未获得高抗黄萎病品种。除了Ve基因外，一些下游防卫相关基因也用于抗黄萎病防治研究。过量表达AtNPR1基因的转基因棉花对非落叶型黄萎病具有抗性，但是对落叶型黄萎病不具有抗性(Parkhietal.2010)。另外，水稻黄单胞菌harpin蛋白、几丁质酶基因、脂质转移酶基因、天麻抗真菌蛋白、抗菌肽、防御素(θ-Defensins)(Miaoetal.,2010；Munis,2010；NiMetal.,2013)也对黄萎病表现出一定的抗性，但是由于防卫基因的过量表达对植物生长发育带来一些不利影响、以及抗性效果未达到预期目标等，从而限制了这些基因在生产上的应用。本研究通过陆地棉高抗黄萎病品种奥3503的转录组进行分析，发现一个受黄萎病侵染诱导表达的基因LRK2，该基因与雷蒙德氏棉LYK2-Like基因(GossypiumraimondiiproteinLYK2-like，登录号XM_012602491)相似度98％，以该基因的序列为模板设计引物将LRK2基因克隆，并将该基因转化拟南芥，获得的转基因拟南芥植株对落叶型以及非落叶型菌系均具有较高的抗性。棉花黄萎病抗性基因LRK2的分离可以进一步丰富抗性基因资源，对其功能研究为该类基因的进一步利用奠定基础。三、
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的是：提供了一个赋予植物黄萎病抗性LRK2基因的应用，该基因编码一个表面受体蛋白，受黄萎病病原菌诱导后表达量显著增加。该基因表达可以显著提高受体植物对落叶黄萎病病原菌V991以及非落叶型黄萎病菌BP2的抗性。可以利用本专利技术基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高作物抗病性状。技术方案赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因，其序列为SEQIDNO.1。该基因来源于陆地棉品种奥3503。LRK2基因完整编码框长度为2016个碱基，编码蛋白含671个氨基酸，分子量为74KD，等电点为7.85。本专利技术还提供了含有本专利技术基因的表达载体和宿主菌以及扩增该基因的任一片段的引物。本专利技术赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因，该基因受棉花黄萎病强致病力菌株V991(徐荣旗，汪佳妮，陈捷胤等.棉花黄萎病菌T-DNA插入突变体表型特征和侧翼序列分析.中国农业科学,2010,43(3):489-496)的诱导后表达量增加，将LRK2与pCambia2301(上海北诺生物科技有限公司)载体构建植物表达载体转化拟南芥，结果该基因对棉花黄萎病强致病力落叶型菌株V991以及强致病力非落叶型菌株BP2均具有较高抗性。可以利用本专利技术基因构建成各种植物表达载体，应用于农业生物技术育种以提高黄萎病相关寄主植物的抗病性状或用在棉花黄萎病抗性改良中。LRK2的功能研究可为揭示其表达调控机理以及具体功能打下基础，还可应用于植物抗病基因工程以及抗逆性的基因工程改良中。所述LRK2基因在拟南芥植物黄萎病抗性中的的应用。包括：1)LRK2基因的克隆以及植物表达载体的构建以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物P1:5’-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3’，P2:5’-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3’扩增得到2016bp片段，将该片段命名为LRK2，PCR产物纯化后用XbaI/BamHI酶切，连接到pCambia2301载体，测序后成功构建的重组载体命名为pCambia2301:LRK2；2)转基因植株的获得将步骤1)中构建好的pCambia2301:LRK2质粒用冻融法转化农杆菌LBA4404，用蘸花法转化拟南芥，当代的拟南芥植株为T0代，收获的种子为T1代，T1代种子在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上筛选，获得候选的阳性T1植株，分别在DNA和RNA水平上检测目的基因是否转入以及是否成功表达：用引物P3:5’-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3’P4:5’-TGCCCTTAATTCATCTGCGC-3’扩增候选的阳性T1代植株的DNA和cDNA进行PCR鉴定，在DNA和cDNA水平均能扩增获得821bp大小片段的T1植株则为成功转化LRK1的阳性转基因植株。收获的种子为T2代。T2代阳性转基因植株在含25mg/mL卡那抗生素的1/2MS培养基上生长，且具有黄萎病抗性。有益效果1.本专利技术获得了一个全新的赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因。本专利技术获得的LRK2基因来源于陆地棉品种奥3503，该基因受棉花黄萎病病原菌诱本文档来自技高网...

【技术保护点】
赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因,其序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.赋予植物黄萎病抗性的LRK2基因,其序列为SEQIDNO.1。
2.权利要求1所述LRK2基因的应用。
3.权利要求1所述LRK2基因在植物黄萎病抗性中的的应用。
4.权利要求1所述LRK2基因在拟南芥植物黄萎病抗性中的的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，包括：
1)LRK2基因的克隆以及植物表达载体的构建
以陆地棉品种奥3503的cDNA为模板，用引物
P1:5’-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3’，
P2:5’-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3’
扩增得到2016bp片段，将该片段命名为LRK2，PCR产物纯化后用XbaI/BamHI酶切，连接
到pCambia2301载体，测序后成功构建的重组载体命名为pCambia2301:LRK2；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘廷利，顾周航，周雪平，张保龙，杨郁文，陈天子，凌溪铁，王金彦，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32