一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列，包括tetO-F、tetO-R和tetO-F-GC；以及一种采用如上引物序列进行水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分类检测方法，通过所提供引物序列进行PCR扩增及变性梯度凝胶电泳技术，来达到分类检测tetO序列的目的。本发明专利技术通过设计引物，将PCR-DGGE技术应用于tetO序列的分类鉴定，较传统方法省去了DNA的分离纯化、载体连接及转化、阳性克隆的筛选、序列大量测序等耗工耗时耗费高的步骤，同时能得到样本中较全面的tetO序列信息，使整个操作变得简单、快速、节省成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及水体及沉积物中DNA提取技术、PCR扩增技术、变性梯度凝胶电泳技 术及传统测序
，更具体地涉及一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因 tetO的引物序列及对应检测方法，以最终达到分离鉴定不同tetO序列的目的。
技术介绍
抗生素是在低浓度下，能选择性地抑制或杀伤它种微生物或肿瘤细胞的微生物次 级代谢产物和采用化学或生物学等方法制得的同类化合物与结构修饰物。抗生素广泛应用 于医药业和畜禽养殖业。近年来，抗生素的家庭性及医源性使用量大幅增加。由于机体服 用的抗生素仅有约25%左右被机体吸收消化，大部分以原化学态随排泄物排出，使大量未 及消化的抗生素随污水直接排放到环境中。在环境中残留的抗生素除了具有直接的生物毒 性外，更可以促进抗药细菌在环境中的累积及抗药基因的传播，使携带有抗生素抗性基因 的细菌最终进入食物链进入人体内，就会引发无法治愈的细菌性疾病，给人类的健康带来 严重的威胁。抗生素在环境中的各种传播途径中，以水体传播途径的距离长、范围广，给周 围环境带来的危害大，因此，对水体及沉积物中进行抗性的检测和定量及风险评估，具有十 分重要的意义。 四环素类抗生素是最早开发的广谱抗生素，已有半个多世纪的应用历史。近年来 其向环境水体中的排放量日益升高，在养殖场废水中的最高浓度可达90 y g/L，同时由于其 不断排放所造成的环境选择压力，使环境水体中的四环素类抗性基因污染日益严重。核糖 体保护机制、外排栗机制和酶学修饰机制是微生物抵抗四环素类抗生素侵扰的三种主要途 径，而有相关报道指出，核糖体保护机制相关的四环素类抗性基因在水体中占有优势，其中 tetO丰度较高。 据现有的研究结果显示，tetO基因存在一定的多样性，不同种菌所含的tetO序列 存在一定差异。然而目前对于tetO基因的检测技术，有常规的PCR定性方法，也有基于焚 光染料的定量PCR方法，但当在样本中混杂有多种tetO基因时，上述方法均不能有效地对 多种tetO基因进行有效地分类鉴定。传统的通过连接转化来扩增基因至载体细菌中，再通 过蓝白斑筛选、挑取大量阳性克隆并测序的方法虽然能够达到全面分析样本中不同基因的 目的，但操作费时费力、后期分析费用较高，因此并不常用。 变性梯度凝胶电泳技术（denatured gradient gel electrophoresis，以下简称 DGGE)是一种基于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的DNA分离技术，在含有浓度线形递增的变性 剂（尿素和甲酰胺的混合物）的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，可将长度相同但碱基排列不同的 双链DNA分离开来。DGGE技术由于其重复和操作简单等特点，已广泛用于分析自然环境中 细菌、蓝细菌、古菌、微型真核生物、真核生物和病毒群落的生物多样性。因此，采用DGGE技 术对环境样本中的tetO基因进行分类鉴定，不仅能够得到样本中完整的tetO序列信息，而 且能够根据所获信息分析其来源，对于研究tetO基因在环境中的传播及溯源、并进一步控 制其传播具有十分重要的意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性 基因tetO的引物序列，再一目的在于提供一种水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的分 类检测方法，达到对于样本中不同tetO基因分离鉴定的目的。 为了实现上述目的，本专利技术研制了扩增不同tetO基因的通用引物，引物名称分别 为tet〇-F、tet〇-R和tet〇-F_GC，使用tet〇-F和tet〇-R可扩增tetO基因可变区的基因片 段，使用tetO-F-GC和tetO-R可扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段。序列如 下： tet〇-F :5' -3' CGTTATTTCCCGTTTATC ; tet〇-R :5' -3' ATCGTTGTTTGGAGCATA ;或者 tet〇-F-GC :5 '-3 ' CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG-GGCACGGGGGGCGTTATTTCCCGT TTATC。 本专利技术研制了一种扩增并分离鉴定水体及沉积物样本中不同tetO基因的方法， 其具体方案如下： 1.提取水体及沉积物总DNA ; 2.以tet〇-F-GC和tet〇-R为引物，使用PCR方法扩增带有GC夹子的tetO基因可 变区基因片段； 3.将所得到的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳； 4.对电泳后的凝胶进行染色、切下含有分离tetO基因片段的凝胶，浸提其中的 DNA分子； 5.以浸提液为模板，以tet〇-F-和tet〇-R为引物，重新扩增其中的序列，以DNA测 序仪进行测序，再通过序列比对分析以检测其种类。 本专利技术通过设计引物，将PCR-DGGE技术应用于水体及沉积物样本中tetO序列的 分类鉴定中，较传统方法省去了 DNA的分离纯化、载体连接及转化、阳性克隆的筛选、序列 大量测序等耗工、耗时、耗费较高的步骤，同时能够得到样本中较为全面的tetO序列信息， 使整个操作过程变得简单、快速、节省成本，也为开发其他相关抗生素抗性基因的分类分析 提供借鉴。【附图说明】 图1是本专利技术的分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的方法的操作流 程图； 图2是通过本专利技术设计的引物应用于实际样本中的扩增结果DGGE电泳图谱； 图3是对应于图2中所得四环素抗性基因tetO序列通过测序并BLAST比对后建 立的Neighbour-Joining系统发育树。 具体实施方案 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照 附图，对本专利技术作进一步的详细说明。 本专利技术公开了几种扩增不同tetO基因的通用引物，包括正向引物（tetO-F-GC和 tet〇-F)和反向引物（tet〇-R)，使用tet〇-F和tet〇-R可扩增tetO基因可变区的基因片段， 使用tet〇-F-GC和tet〇-R可扩增带有GC夹子的tetO基因可变区基因片段。序列如下： tet〇-F :5' -3' CGTTATTTCCCGTTTATC ; tet〇-R : 5 ' -3 ' ATCGTTGTTTGGAGCATA ;以及 tet〇-F-GC :5 '-3 ' CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGG-GGCACGGGGGGCGTTATTTCCCGT TTATC。 此外，本专利技术还公开了一种扩增并分离鉴定水体及沉积物样本中不同tetO基因 的方法，包括以下步骤： 1 ?提取水体及沉积物的总DNA; 2.以tet〇-F-GC和tet〇-R为引物，使用PCR方法扩增带有GC夹子的tetO基因可 变区基因片段； 3.将所得到的PCR产物进行变性梯度凝胶电泳； 4.对电泳后的凝胶进行染色、在300nm紫外灯下切下含有分离tetO基因片段的凝 胶，浸提其中的DNA分子；其中切下的凝胶为分散条带，随后将其置于双蒸水中浸泡，4°C下 存放过夜以实现浸提操作； 5.以浸提液为模板，以tet〇-F和tet〇-R为引物，重新扩增其中的序列； 6.将得到的PCR产物以DNA测序仪进行测序，再通过序列比对分析以检测其种类。 作为优选，进行变性梯度凝胶电泳时使用的变性剂为聚丙烯酰胺溶液，其中聚丙 烯酰胺浓度为8% (本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于分类检测水体及沉积物中四环素抗性基因tetO的引物序列，其特征在于，所述引物序列如下所示：tetO‑F：5’‑3’CGTTATTTCCCGTTTATC；tetO‑R：5’‑3’ATCGTTGTTTGGAGCATA；或者tetO‑F‑GC：5’‑3’CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGC‑ACGGGGGGCGTTATTTCCCGTTTATC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：强志民，王健，贲伟伟，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11
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