本发明专利技术公开了一种红木中交趾黄檀DNA鉴定的方法及专用引物和探针。本发明专利技术公开了交趾黄檀DNA鉴定的专用引物、探针和方法，所述引物和探针具有交趾黄檀的专属特异性，所述方法为荧光定量PCR。本发明专利技术一方面检测样本量少，不会破坏木材及其木材成品本身的结构形态。另一发面以木材特有的DNA信息为依据，能快速、准确、客观地获得交趾黄檀的种属鉴定结果，避免了传统鉴定方法必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构基础上的缺陷，因此具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及木材材种鉴定的分子生物学检测领域，具体地说涉及对交趾黄檀的DNA鉴定方法及其专用的引物和探针。
技术介绍
《红木国家标准》自2000年颁布实施，《红木国家标准》中把“红木”范围的树种列为“五属八类”。这“五属八类”中共包括了 33种木材。5属:即紫檀属、黄檀属、柿属、豆属及铁刀木属。8类:则是以木材的商品名来命名的，即紫檀木类、花梨木类、香枝木类、黑酸枝类、红酸枝木类、乌木类、条纹乌木类和鸡翅木类。交止黄檀cochinchinensisW&H “大红酸枝”，属于红木国标中豆科家族的黄檀属、黑酸枝类。产于东南亚地区，包括柬埔寨各地，老挝中部和南部，泰国东北部、东部和中部，越南广平省以南地区。红木行业通常指的大红酸枝一般即指老挝大红酸枝即交趾黄檀，是公认的最好酸枝木，俗称老红木。传统的红木鉴定识别方法是利用人工经验进行识别，主要通过对木材截面进行人工观察的方式完成。对交趾黄檀的鉴定目前采用的也是传统的红木鉴定方法。所谓的传统鉴定方法主要依赖宏观识别，而微观识别则需要使用光学显微镜观察其内部的解剖结构特征，也就是观察构成木材的各类细胞与组织的形态及排列特征，该方法涉及的识别特征较多，鉴定相对准确，但对于鉴定工作者的要求很高，要对此做出准确的鉴定，必须具有丰富的实践经验。近年来研究工作者开发了基于数字图像处理的木材图像识别技术，大大提高了木材识别的准确性，推动了木材识别技术的发展。但是，无论是基于识别者经验的传统识别技术还是基于计算机图像检索的识别技术，都没有脱离木材本身的形态结构及特征，鉴定识别工作都必须建立在所检木材有完整易辨识的形态结构的基础上，这就为木材识别工作带来了一定的局限性，同时，相近种属木材易出现材质结构的相似，为木材识别的准确性带来困难。若能建立起以红木木材基因多样性的分子鉴定技术，一方面可以杜绝红木制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范红木市场；另一方面，为检验检疫、农林、工商的快速筛查和鉴定提供技术方法，促进物种资源的保护和利用，提高进出口的检验检疫的准确性。然而，目前对交趾黄檀的鉴定依然采用传统的木材鉴定手段，即解剖切片观察木材的构造以及形态特征从而得出判定结果。因此建立起交祉黄檀的分子鉴定方法，实现交趾黄檀的简单、快速、准确、客观的鉴定是目前急需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术提供一种交趾黄檀DNA鉴定的专用引物和探针，所述引物和探针序列包括:JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’JZHT Primer Probe:5’-VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3'。进一步地，所述引物和探针的PCR反应条件为:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40个循环。进一步地，所述引物和探针的使用浓度比为:JZHT Primer-F: JZHTPrimer-R:JZHT Primer Probe=1:1:2。本专利技术还提供了一种交趾黄檀DNA鉴定的方法，包括如下步骤: (1)木材样本的预处理； (2)提取经(I)处理后的木材样本中的DNA; (3)利用引物JZHT Primer-F 和 JZHT Primer-R，以及探针 JZHT Primer Probe 对(2)中提取的DNA进行荧光PCR扩增； (4)木材种类的确定； 所述引物和探针序列包括:JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’JZHT Primer Probe:5' -VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3’。进一步地，所述的荧光PCR扩增条件为:95°C，2min ;95°C 15s，55°C 34s，共40个循环。本专利技术与现有技术相比具有以下优点和效果:本专利技术通过一对特异性扩增引物及MGB探针对目的基因进行扩增，条件依赖少，一般的PCR实验室设备即可满足，对结果的分析非常直观，不用比对复杂的测序图谱，直接根据扩增曲线即可做出分析该位点基因型。实时荧光定量PCR技术(real time quantitative PCR，RQ-PCR)具有较高的灵敏度和特异性，而且能对扩增产物进行实时检测。该法综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，解决了 PCR产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，易于统一标准。本专利技术在对交趾黄檀大量基因信息进行分析比较的基础上，通过采用荧光定量PCR技术实现对交趾黄檀分子水平上的条形码鉴定。并根据序列位点多态性，设计交趾黄檀种属特异引物和探针，建立了交趾黄檀特异性的荧光定量PCR鉴定检测方法。本专利技术并不需要木材有完整的形态结构，只需从木料上取极少量木材样本，即可满足检测要求，操作简单。并且通过木材特有的DNA信息做出判断，鉴定过程客观、准确。克服了传统鉴定方法主要依赖于形态鉴定方法，并必须建立在木材有完整易辨识的形态结构的基础上的技术局限性。本专利技术很好地满足各相关部门对交趾黄檀快速筛查和鉴定的要求，能有效杜绝交趾黄檀制品的掺假造假行为，对于保护消费者权益，提高品牌价值，规范市场，促进物种资源的保护和利用具有重要的意义。【附图说明】图1是红木中交趾黄檀和15个对照组树种DNA提取效果。图2是本专利技术方法特异性实验结果。图3是本专利技术方法灵敏度实验结果。图4是取自针对经不同处理方式得到的木材样本的检测结果。图5是取自木材不同部位的检测结果。【具体实施方式】下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。但并不因此将本专利技术限制在所述的具体实施例中。实施例中未说明的条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法:譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照商品说明书建议的步骤和条件。实施例1检测交趾黄檀的引物、探针和检测试剂盒 利用NCBI等资源信息，找出交趾黄檀与其他木材的基因差异位点，筛选出一对特异性扩增引物对(JZHT Primer-F和JZHT Primer-R),并在该引物对的扩增区域设定了一条特异性的探针(JZHT Primer Probe)。所述扩增引物对和探针序列分别是:JZHT Primer-F:5’- CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT -3’JZHT Primer-R:5’- CGAATCCACCACGAACCC -3’JZHT Primer Probe:5' -VIC- CAACCCGTGCGCCT -MGB-3’。一种检测交趾黄檀的试剂盒，所述试剂盒包括样品DNA抽提试剂、qPCR扩增反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品。其中所述qPCR扩增反应体系为:20μ1的体系包括: SYBR Prmix Taq II (2Χ )ΙΟμΙ ROX Referance Dye II (50Χ ) 0.4μ1 JZHT Primer Probe0.4μ1 JZHT Primer-F (20μΜ)0.2μ1 JZHT Primer-R本文档来自技高网...
【技术保护点】
交趾黄檀DNA鉴定的专用引物和探针，其特征在于，所述引物和探针序列包括：JZHT Primer‑F：5'‑ CATCGAGTCTTTGAACGCAAGT ‑3'JZHT Primer‑R：5'‑ CGAATCCACCACGAACCC ‑3'JZHT Primer Probe ：5'‑VIC‑ CAACCCGTGCGCCT ‑MGB‑3'。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张明哲，陈吴健，徐莉莉，尹文秀，吴志毅，林晓佳，
申请(专利权)人：浙江出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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