本发明专利技术公开了大豆花叶病毒抗性基因RSC8的分子标记及其应用。其中包括大豆分子育种领域的两对用于筛选与大豆抗大豆花叶病毒相关的抗性基因RSC8的新的引物对，分子标记的制备方法及应用。经过分析表明，开发出的分子标记ZL-39和ZL-52能准确跟踪大豆抗病品种科丰1号的抗性基因RSC8，预测大豆对大豆花叶病毒的抗性，从而更加方便地在实验室条件下对抗大豆花叶病毒材料进行鉴定和筛选。利用分子标记辅助育种技术能避免环境因素及人为因素对表型造成的影响，本发明专利技术中开发出的两对与抗性基因RSC8紧密连锁的分子标记ZL-39和ZL-52能提高抗大豆花叶病毒育种材料选择的准确性，实现大豆抗大豆花叶病毒育种的目标。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及大豆分子育种领域，尤其涉及一种鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基因 rsc；8的引物对、分子标记、分子标记方法及应用。
技术介绍
大豆花叶病毒（Soybeanmosaicvirus，SMV)病是一种世界性病害，在世界各大豆 产区均有发生。1899年在我国东北初见报道，随后山东、江苏和湖北等省相继报道了该病的 危害，SMV在我国从北到南均有发生。一般情况下，SMV引起的产量损失在15-35%，某些地 区的重发生年份，引起的产量损失可达70 %以上，甚至绝产（Ren等，1997)。SMV与寄主以 及环境长期的共同进化过程中，发生了致病性分化，产生了不同的致病类型，称之为株系。 目前，我国利用一套统一的鉴别寄主体系，统一将全国SMV划分为22个株系：SCl-SC22(Li 等，2010 ;王大刚等，2013)。 其中SC8是在我国黄淮和长江中下流域大豆产区广泛分布的SMV株系。筛选抗源、 培育和种植抗病品种是控制SMV最经济、安全和有效的方法。科丰1号是一种广谱抗源，除 对SC8株系表现高抗以外，对另外21个株系中的17个株系均表现高抗。遗传分析表明，科 丰1号对SC8株系由1对显性的抗性基因（Rsra)控制。所以选育含Rsra抗性基因的大豆品 种是控制大豆花叶病毒病危害最经济、有效的方法之一。 对已经研宄清楚的抗性基因加以有效利用，可以缩短育种周期，满足国内目前对 抗SMV优质大豆品种的迫切需要。然而，利用传统的田间或室内接种鉴定的方法对大豆花 叶病毒抗性基因Rsra进行后代追踪不仅耗时耗力，而且存在诸多不确定因素，利用分子标记 辅助选择方法可以有效的解决这一难题。Wang等（2010)利用基因组SSR标记将大豆花叶 病毒抗性基因RSJ艮定在大豆2号染色体上不足200kb的区域内。这为进一步筛选与大豆 花叶病毒抗性基因RSC8紧密连锁甚至共分离的SSR标记奠定了基础。基于此，专利技术人通过 开发新的标记，利用连锁分析的方法对大豆花叶病毒抗性基因Rsra进行了精细定位，进一步 将大豆花叶病毒抗性基因1?%8锁定在大豆2号染色体上30. 8kb的区域内，并发现了与RSC8 紧密连锁的分子标记，能有效提高大豆抗SMV育种中对抗病材料选择的效率和准确性，加 速了标记辅助选择技术在SMV抗性品种选育过程中的利用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种与大豆花叶病毒抗性基因Rsra紧密连锁的分 子标记。 本专利技术要解决的另外一个技术问题是提供鉴定上述分子标记的引物对。 本专利技术还有一个要解决的技术问题是提供一种鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基 因Rsra的分子标记的制备方法。 本专利技术还有一个要解决的技术问题是提供上述分子标记的应用。 本专利技术的上述目的可以通过以下技术方案实现： 本专利技术的抗性基因Rsra来自大豆抗性品种科丰1号，该抗性基因位于大豆的2号 染色体上，具有广谱抗性。 本专利技术首先根据抗性基因Rsra的初定位结果，利用目标基因区段内的序列设计 特异性引物，发掘用于鉴定抗性基因RSC8的分子标记，并将其应用于由科丰1号X南农 1138-2构建的F2群体中进行筛选，结合表型分析，发现不同带型对应的抗性强弱差异达到 了显著或极显著水平。 本专利技术用于鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基因Rsra的分子标记，包括分子标记 ZL-39和ZL-52;分子标记ZL-39和ZL-52,是以大豆科丰1号和南农1138-2的基因组DNA 为模板进行PCR扩增所得的片段；分子标记ZL-39和ZL-52与抗性基因Rse8之间的遗传距 离分别为2. 2cM和1. 6cM。 本专利技术用于扩增分子标记ZL-39的引物对，包括具有SEQIDNO:1所示的核苷酸 序列的上游引物和具有SEQIDNO:2所示的核苷酸序列的下游引物。 本专利技术用于扩增分子标记ZL-52的引物对，包括具有SEQIDNO:3所示的核苷酸 序列的上游引物和具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的下游引物。 本专利技术提供了一种鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基因Rsra的分子标记的制备方 法，包括以下步骤： (1)大材料基因组DNA的提取： 以苗期新鲜叶片为材料，采用CTAB法提取DNA，详细步骤如下： 1)取大豆嫩叶2-3g，在液氮中研成粉末，倒入65°C预热30min左右的装650yL CTAB提取缓冲液的离心管中，再加入20yL0 -巯基乙醇，65°C水浴60min左右，期间轻摇 3-5 次； 2)加入624yL的氯仿和26yL的异戊醇溶液，并充分摇匀，放在摇床上轻摇 20min； 3)经lOOOOrpm离心15min，将上清液转入一个新的离心管中； 4)加入200yL冰冻的异丙醇，上下摇匀； 5)经8000rpm离心5min，倒掉液体，加入1000yLTE缓冲液，待完全溶解后，加入 624yL的氯仿和26yL的异戊醇溶液再抽提一次； 6)经8000rpm离心5min，吸取上清液转到一个新的离心管中； 7)加入1000yL的冰冻无水乙醇，在-20°C下静置20min以沉淀DNA; 8)lOOOOrpm离心 5min，弃去上清液； 9) 70%乙醇800yL清洗两次，真空干燥机上吹干； 10)将DNA溶于TE中，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测；置于-20 °C待用； (2)PCR扩增： 将用于扩增分子标记ZL-39的引物对或用于扩增分子标记ZL-52的引物对加入 PCR反应体系，并对大豆育种群体植株的DNA进行扩增；扩增体系为4. 0yLTaqXMaster PCRMix，2. 0yL浓度为 1. 0ppmol/L上下游引物，20.Ong/yL模板DNA3. 0yL，ddH20 1. 0yL;反应总量10. 0yL;PCR程序：94°C预变性5min，每个循环95°C变性60s，55°C退火 50s，72°C延伸60s，共30个循环，最后72°C延伸10min，12°C保存； (3)PCR产物检测： PCR反应产物在质量比8%非变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，用硝酸银染色并于凝 胶成像系统下观察，记载。 (4)鉴定结果： 能扩增出与科丰1号相同片段或包含其片段的植株为含有大豆花叶病毒抗性基 因RSC8的植株；反之，仅能扩增出与南农1138-2相同片段的植株为不含有大豆花叶病毒抗 性基因Rsra的植株。 本专利技术还提供了用于鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基因Rsra的分子标记ZL-39和 ZL-52,以及用于扩增分子标记ZL-39的引物对和用于扩增分子标记ZL-52的引物对在大豆 抗大豆花叶病毒材料创制中的应用。 本专利技术还提供了用于鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基因RSC8的分子标记ZL-39和 ZL-52,以及用于扩增分子标记ZL-39的引物对和用于扩增分子标记ZL-52的引物对在分子 标记辅助大豆抗大豆花叶病毒育种中的应用。 本专利技术还提供了一种含有用于扩增分子标记ZL-39的引物对和用于扩增分子标 记ZL-52的引物对的试剂盒。 本专利技术还包括上述试剂盒在大豆抗大豆花叶病毒材料创制中的应用，以及上述试 剂盒在分子标记辅助大豆抗大豆花叶病毒育种中的应用。 本专利技术的有益效果是： 大豆花叶病毒病是严重影响大豆生产的一种病毒病害，本专利技术利用分子生物学和 生物信息学的方法筛选到与大豆花本文档来自技高网...
【技术保护点】
鉴定和筛选大豆花叶病毒抗性基因RSC8的分子标记，其特征在于：包括分子标记ZL‑39和ZL‑52；所述分子标记ZL‑39和ZL‑52与抗性基因RSC8之间的遗传距离分别为2.2cM和1.6cM。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王大刚，张磊，黄志平，李杰坤，胡国玉，吴倩，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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