一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用。斑鸠霉素的生物合成基因簇，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3411-15678位所示，包含3个基因：杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶基因ikaA、FAD依赖的氧化还原酶基因ikaB及类Michael环化反应酶基因ikaC。本发明专利技术所提供的斑鸠霉素的生物合成相关的所有基因和蛋白信息，有助于阐释多环tetramate大环内酰胺家族天然产物的生物合成机制，为进一步遗传改造提供理论基础和材料。本发明专利技术所提供的基因及蛋白可以用于自然界中挖掘或创制可用于医药卫生及工农业的化合物或基因和蛋白。

【技术实现步骤摘要】
一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用
: 本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及一种斑鸠霉素的生物合成基因簇及其应用。
技术介绍
: 斑鸠霉素(Ikarugamycin)属于多环tetramate大环内酰胺类化合物,其结构式如图1的式I所示，其具有独特5-6-5三环系统以及抗菌及抗肿瘤细胞等多种生物活性。目前斑鸠霉素已作为抗肿瘤先导化合物引起关注，相应的具体药理机制正在深入研究中。 近年来蓬勃发展起来的组合生物合成技术，为改造斑鸠霉素的生产菌Streptomyces sp.ZJ306带来了新的机遇。在阐明了自然界的生物合成途径、理解自然界聚酮化合物天然组合生物合成机理的基础上，人们可以采用组合生物合成技术对抗生素的生物合成基因、调控基因进行体内敲除、突变、置换和重组等操作，不但能够生产“非天然”的天然产物结构类似物，而且还可以提高天然产物的产量，或定向积累所需要的天然产物，为天然产物的发现和药物开发提供化合物结构和生物活性多样化。 迄今为止，有关珠江口源微生物中斑鸠霉素生物合成基因簇、类Michael环化反应酶等生物催化制备斑鸠霉素及基因敲除获得斑鸠霉素类似物等，国内外尚未见报道。
技术实现思路
: 本专利技术的目的是提供一种斑鸠霉素的生物合成基因簇。 本专利技术是以珠江口沉积物源放线菌Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素为目标分子，在筛选到生物合成基因簇基础上，综合运用分子生物学、微生物学、合成生物学、生物化学及有机化学相结合的技术，阐明了斑鸠霉素的生物合成机制，为利用组合生物合成方法修饰改造斑鸠霉素类似物提供依据，为药物筛选提供化合物实体。 本专利技术的斑鸠霉素生物合成基因簇来源于珠江口沉积物放线菌Streptomycessp.ZJ306，其特征在于，该生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第3411-15678位的碱基序列所示，包括3个基因,具体为: (I)负责斑鸠霉素的聚酮-鸟氨酸-聚酮骨架合成的基因，即ikaA，位于核苷酸序列(SEQ ID N0.1，下同)第3411-12785个碱基处，长度为9375个碱基对，编码杂合的聚酮/非核糖体聚肽合成酶，3124个氨基酸； (2)负责斑鸠霉素骨架合成修饰的另一个基因，即ikaB，位于核苷酸序列第12782-14614个碱基处，长度为1833个碱基对，编码FAD依赖的氧化还原酶，610个氨基酸； (3)负责斑鸠霉素的还原型环化反应的基因，即ikaC，位于核苷酸序列第14614-15678个碱基处，长度1065个碱基对，编码乙醇脱氢酶，354个氨基酸。 SEQ ID N0.1 (序列表)所示序列的第3411-15678位碱基序列的互补序列可根据DNA碱基互补原则随时得到，且第3411-15678位碱基序列或部分核苷酸序列可以通过聚合酶链式反应(PCR)或用合适的限制性内切酶酶切相应DNA或DNA重组技术获得。 本专利技术提供了构建至少包含部分SEQ ID N0.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段的重组DNA载体途径。 本专利技术还提供了创制斑鸠霉素生物合成基因被阻断或异源表达等其他基因改造的途径，至少其中之一的基因包含SEQ ID N0.1所示序列的第3411-15678位中DNA片段。 本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可使用PCR探针法或Southern杂交等技术，从其他生物体重筛选获得斑鸠霉素的生物合成基因簇同源基因。 本专利技术提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可用于Streptomyces sp.ZJ306基因组文库中定位更多的文库质粒。这些文库质粒至少包括本专利技术中的部分序列，也包含Streptomyces sp.ZJ306基因组中邻近区域未克隆DNA。 包含本专利技术所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的DNA片段，可以被体内外突变等修饰，包括插入、置换、缺失、易错聚合酶链式反应、位点特异性突变、不同序列重组、定向进化等。 包含本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的克隆，可以通过合适表达系统在外源宿主中表达生产相应酶或者提高生物活性化合物产量。这些外源宿主包括大肠杆菌、链霉菌、假单胞菌、芽孢杆菌、酵母及动植物等。 本专利技术提供的氨基酸序列可以用于分离所需蛋白并可用于抗体制备。 包含本专利技术所提供的氨基酸序列或者部分序列的多肽，可能在去除或者替代某些氨基酸之后仍有生物活性甚至新的生物活性，或提高了产量或优化了蛋白动力学特征或其他致力于得到的性质。 包含本专利技术所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在异源宿主中表达及揭不它们在宿主代谢中的功能。 包含本专利技术所提供核苷酸序列或部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通过DNA重组技术构建重组载体，以获得新型生物合成途径，也可以通过插入、置换、缺失或失活，进而获得其他基于生物合成途径的新结构化合物。 本专利技术提供了斑鸠霉素的生物合成基因簇在制备斑鸠霉素及其类似物中的应用。 本专利技术提供了一种类Michael环化反应酶基因ikaC，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1第14614-15678位碱基所示。 上述类Michael环化反应酶基因ikaC编码的类Michael反应环化酶IkaC。 类Michael反应环化酶IkaC在制备斑鸠霉素中的应用，如催化化合物3形成斑鸠霉素化合物I。 本专利技术提供了类Michael环化反应酶基因缺失突变株中斑鸠霉素类似物的创制应用。 总之本专利技术所提供的包括斑鸠霉素生物合成相关的所有基因和蛋白信息，帮助人们理解多环tetramate大环内酰胺家族天然产物的还原型环化等关键机制，为进一步遗传改造提供材料和理论基础。本专利技术所提供的基因和蛋白质可以用来寻找和发现可用于医药、卫生或农业的多环tetramate大环内酰胺家族、基因或蛋白。 本专利技术的放线菌Str印tomyces sp.ZJ306于2014年3月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)Jia:中国武汉武汉大学，其保藏编号为:CCTCC N0.M2014081。【附图说明】: 图1是斑鸠霉素(化合物I)及生物合成中间体化合物3、以及化合物2的化学结构式。 图2是Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素的生物合成基因簇结构示意图和限制性内切酶谱(S，SacI ;E, EcoRI;B, BglII;P, Pvu1.)。 图3A是遗传改造Streptomyces sp.ZJ306中斑鸠霉素生物合成基因簇获得的突变株，在发酵培养基中的丁酮粗提物的HPLC分析图:1:野生型Streptomyces sp.ZJ306 ；I1:突变株AikaA ；111:突变株AikaB ；IV:突变株Λ ikaC ;图中阿拉伯数字表示斑鸠霉素及其中间体，其中1、2和3分别代表图1中的式1、式2和式3表示的化合物。 图3B是ikaA、ikaAB和ikaABC在S.1ividans TK64中表达的工程菌株发酵产物HPLC 分析图。如图:V:TK64/pCSG3611 (ika cluster) ；V1:TK64/pCSG3615 (ikaA) ;VI1:TK64/pCSG3614 (i本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种斑鸠霉素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第3411‑15678位的碱基序列所示。

【技术特征摘要】
1.一种斑鸠霉素的生物合成基因簇，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1的第3411-15678位的碱基序列所示。2.权利要求1所述的斑鸠霉素的生物合成基因簇在制备斑鸠霉素及其类似物中的应用。3.一种类Michael环化反应酶基因ikaC，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1第14614-1567...

【专利技术属性】
技术研发人员：张长生，张光涛，张文军，张庆波，朱义广，张海波，李苏梅，马亮，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44