本发明专利技术公开一种新型抗肿瘤amiRNA序列，其包含下列序列中的任意一条或一条以上：amiRNA-hTERT?1：正义链5’-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’；反义链5’-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’；amiRNA-hTERT?2：正义链5’-CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’；反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’；amiRNA-hTERT?3：正义链5’-CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’；反义链5’-TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’。本发明专利技术能抑制肿瘤的生长、增殖和迁移，使肿瘤细胞进入衰老状态而促其凋亡。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及ー种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用。
技术介绍
端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一小段重复的DNA序列5’-GGTTAG_3’，它与端粒结合蛋白一起构成了特殊的“帽子”结构，維持着染色体和基因组的完整性与稳定性(Rlackburn，E. H. Nature, 350, 569-573 ;1991·)。在正常体细胞中，细胞每分裂一次，由于DNA复制时的“冈崎片段”效应，端粒就缩短一点。一旦端粒消耗殆尽，染色体则易于突变而导致凋亡或其它癌变。因此，端粒和细胞 老化有明显的关系。其长度反映着细胞复制史及复制潜能，被称作细胞寿命的“有丝分裂钟” (Kim Sh, S. H.，et al. Oncogene 21,503-511 ；2002.)。当端粒缩短到一定程度时，某些细胞为了逃避短端粒带来的凋亡效应，只有突变产生相应的“端粒維持机制”。通过“端粒維持机制”，这些细胞进行疯狂的増殖和复制，慢慢走向癌化的道路。目前已经报道的“端粒維持机制”除少数是‘非端粒酶依赖型’的外，绝大部分都是‘端粒酶依赖型’的，简单的说就是通过表达端粒酶来实现端粒的延伸或維持((Shayand Roninson,2004)ο端粒酶(Telomerase),在细胞中负责端粒的延长的ー种酶,是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。简单来说，端粒酶是RNA和蛋白质的复合体，如人的端粒酶分别由起模板作用的端粒酶RNA(hTR)、起组装作用的端粒酶结合蛋白(hTPl)和起催化作用的端粒酶逆转录酶(hTERT)组成(01ovnikov，1971)。越来越多的研究表明，在哺乳动物中，各细胞中hTR的表达是普遍的，特异性不强；而hTERT则呈现与端粒酶活性极强的正相关性，是端粒酶活性的限速成份(Meyerson et al. , 1997)。实验表明，约85% -90%的肿瘤细胞中呈现端粒酶活性显著升高，而正常的成体细胞则显示低活性，因而端粒酶作为肿瘤治疗的最理想靶点早已是ー个不争的事实(Hahnet al.，1999)。近年来通过调节端粒酶活性来干预肿瘤的研究日益增多，同时也取得了很好的效果，但主要局限在寡核苷酸和疫苗的临床研究方面(Brunsvig et al. ,2006;Gandellini et al. , 2007)。杰隆(Geron)的GRN163L是此类药物开发中最前沿的一个候选药物，早在2005年，FDA同意GRN163L在患慢性淋巴细胞白血病患者的临床实验。2007年，Geron公司开始GRN163L单独治疗多发性骨髓瘤的I期临床试验。2008年开始了 GRN163L治疗乳腺癌的I期临床实验。同年12月，Geron发布了有关GRN163L治疗再发的和难治的多发性骨髓瘤的暂时性临床试验数据。2009年,Greron又发布了 Geronl63L对肿瘤干细胞的实验进展，包括非小型细胞肺癌、乳癌、胰脏炎、前列腺癌、小儿科神经肿瘤。数据显示，在以Geix)nl63L治疗后，人类乳癌细胞MCF7的假定干细胞数量与自我再生的能力大幅减弱。目前Geronl63L正处于临床II期试验中同样令人振奋的是KAEL-GemVax公司的抗端粒酶疫苗GVlOOl业已进入临床III期。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指ー种分子生物学上由双链RNA诱发的基因沉默现象，其机制是通过阻碍特定基因的翻译或转录来抑制基因表达。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA吋，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默(C，NapoliCet al.，Plant Cell. 2 :279-289 ；1990)。RNAi现象是生物体中非常普遍的ー种基因调节行为，按其引发源分可以划分为内源性的微RNA(microRNA，miRNA)干扰和外源性的小RNA(small RNA, siRNA)干扰现象(Jinek and Doudna, 2009) amiRNA是一种内源性、20_25bp长的双链RNA，通过与目的基因的部分(极少是完全)互补配对来实现对基因的转录后基因调控作用，在生物体的生长发育各个阶段从未停止工作过。在人体中，高达30%的基因受到miRNA的调控作用(Bartel，2004)。如果单纯从片段长度上进行推算的话，理论上人体基因组应该存在42°_25种符合miRNA长度的微RNA片段，但到目前为止在人类中却只发现1424 种 miRNA,且没有一种已知 miRNA 是直接革巴向 hTERT 的(miRBase Release 17 April,27，2011)。因此，若能根据miRNA形成原理来设计更多靶向作用的人工miRNA (artificialmiRNA, amiRNA)，我们将有可能实现对端粒酶依赖的肿瘤RNAi治疗的新突破。因为目前对端粒酶依赖的肿瘤RNAi治疗方面，由于没有找到ー种直接靶向hTERT的miRNA及siRNA的脱靶效应及毒副作用使得miRNA和siRNA途 径都黯然失色。这就迫使我们将注意力转向新的RNAi方向(即amiRNA)，实验表明，针对于相同的靶点，amiRNA融合了单纯miRNA和siRNA的优点。首先，由于amiRNA设计时采用了 miRNA的原则，具有miRNA的内源性优势，具有比siRNA更高的表达、包装和基因沉默效率，并且能很好的规避siRNA带来的干扰素效应这ー大难题；其次，同样由于amiRNA设计时兼顾了 siRNA的完全配对原则，必然导致amiRNA比常规miRNA具有更强的靶向性和基因沉默作用，同时也降低了难以控制的多靶、脱靶效应(Zeng et al.，2002)。尽管siRNA和miRNA技术都已经非常成熟，也取得了一定的成果，但其干扰效果、特异性和副作用(如脱靶、干扰素效应)却始终不容乐观(Gandellini et al.，2007)。然而，被寄予厚望的amiRNA却只刚刚开始，目前虽有少数有关利用amiRNA来调控靶基因表达的成功案例，但却尚未有利用amiRNA靶向hTERT来实现肿瘤细胞的高效、低毒治疗的报道(Dickins et al.，2005)。因此，寻找和筛选ー些高效、专ー的靶向人端粒酶hTERT基因的amiRNA序列将成为肿瘤RNAi疗法的关键。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种新型抗肿瘤amiRNA序列及其应用，本专利技术的端粒酶hTERT本身是肿瘤细胞的特异性标记之一，本专利技术涉及的amiRNA-hTERT能高效抑制hTERT表达，从而抑制肿瘤的生长、増殖和迁移，同时使肿瘤细胞进入衰老状态而促进其凋亡。为了达到上述目的，本专利技术的技术方案是根据miRNA和siRNA形成和结构特点设计了多条可能靶向hTERT的amiRNA-hTERT序列，通过实验筛选出高效抑制hTERT的amiRNA-hTERT的3条序列，该序列为下述序列中的任意一条或一条以上amiRNA-hTERT I (amiRl):正义链 5，-TGACCAAATGTGCCCTGTA-3，；反义链 5，-TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3 ’ ；amiRNA-hTERT2 (amiR2):正义链 5’ -CAGAGCCACTCACCTTCAA-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种新型抗肿瘤amiRNA序列，其特征在于，其包含下列序列中的任意一条或一条以上，它们的序列为amiRNA-hTERT I(amiRl) 正义链 5’ -TGACCAAATGTGCCCTGTA-3’ ；反义链 5’ -TACAGGGCACACCTTTGGTCA-3’ ；amiRNA-hTERT2(amiR2) 正义链 5’ -CAGAGCCACTCACCTTCAA-3’ ；反义链 5’ -TTGAAGGTGAGACTGGCTCTG-3’ ；amiRNA-hTERT3(amiR3) 正义链 5’ -CAGAGCCAGTCTCACCTTCAA-3’ ； 反义链 5’ -TTGAA...
【专利技术属性】
技术研发人员：许瑞安，唐明青，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：
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