本发明专利技术公开了一种含F/2A序列的抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶(Furin)/口蹄疫病毒2A多肽(F/2A)连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框(ORF)，插入慢病毒表达载体pWPI，构建重组抗p185erbB2全长人鼠嵌合抗体表达载体pWPI/H-F2A-L。经测序鉴定，pWPI/H-F2A-L与预期设计一致。重组慢病毒的感染效率分别为87.68％，感染293T细胞后，有嵌合重链和嵌合轻链的表达。与含IRES的嵌合抗体慢病毒表达载体进行比较，由F/2A介导的嵌合抗体的表达水平要高于由IRES介导的嵌合抗体，为今后抗p185erbB2工程抗体的研究奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及慢病毒表达载体，尤其是一种含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法
技术介绍
c-erbB2/HER2/neu编码产物pl85eAB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。C-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和pl85ertB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。pl85eAB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。pl85ertB2作为肿瘤抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。美国食品及药物管理局(FDA)已于1998年10月正式批准将一株抗pl85ertB2人源化抗体Trastuzumab (商品名Herceptin)用于临床治疗pl85erbB2高表达的转移性乳腺癌。但是，国外进口抗体药物价格昂贵，如何开发出拥有自主知识产权的抗pl85OTbB2基因工程抗体对于国内患者具有十分重要的实际意义，其中，表达载体构建尤为关键。目前构建载体表达抗体分子的主要方式有三类一是将轻、重链基因分别连接至不同表达载体；二是轻、重链基因在同一载体上但处于不同的表达单元；三是以内部核糖体进入位点(IRES)连接轻、重链，使轻重链处于同一表达单元。但是，这些方式存在一些缺陷，如被表达的基因起始效率低，启动子之间相互干扰，上游基因与下游基因的表达不平衡等，造成轻、重链表达水平存在显著差异，导致完整抗体分子表达水平较低。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，为今后抗pl85MbB2嵌合抗体的基础研究及临床应用奠定了基础。含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，该载体是pWPI/H-F2A-L，其中H和L分别是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体重链基因(SEQ. ID. No. 2)和抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因(SEQ. ID. No. I), F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽(SEQ. ID. No. 15)。抗P 185eAB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人P 185ertB2单抗重链可变区基因vH(SEQ. ID. No. 13)和人 IgGl 的重链恒定区基因 Y I (SEQ. ID. No. 14)连接而成 ^pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人pl85ertB2单抗轻链可变区基因vL(SEQ. ID. No. 16)和人IgGl的轻链恒定区基因K (SEQ. ID. No. 17)连接而成。上述含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框0RF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。上述含F/2A序列的抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法包括以下步骤<1>抗P185ertB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增 用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-B扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L ;扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因； <2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建①接头片段F2A的合成该片段由3部分构成含NsiI酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含PvuII酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列；②中间质粒pUC57/F2A的构建将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamH I和Xba I之间，获得中间质粒pUC57/F2A ；③含有嵌合轻链的质粒PUC57/F2A-L的构建用BamH I和Xba I双酶切质粒PUC57/F2A，酶切产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒分别回收接头片段F2A和载体片段PUC57 ;进而用Pvu II酶切接头片段F2A，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Pvu II酶切位点的接头片段F2A ;用Pvu II和Xba I双酶切嵌合轻链L，获得5’端为Pvu II酶切位点和3’端为Xba I位点的轻链片段L ;然后，将这两个片段用T4DNA连接酶连接后克隆入载体PUC57，获得含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L ；④片段H-F2A-L的拼接用BamH I酶和Xba I酶切pUC57/F2A_L，获得片段F2A-L ;进而用Nsi I酶切片段F2A-L，获得5’端为Nsi I酶切位点和3’端为Xba I酶切位点的片段F2A-L ;用BamH I和Nsi I双酶切嵌合重链H，获得5’端为BamH I酶切位点和3’端为Nsi I位点的重链片段H ;通过T4DNA连接酶与片段F2A-L相连，获得5’端为BamHI酶切位点和3’端为Xba I位点的嵌合抗体全长片段H-F2A-L(SEQ. ID. No. 3)；<3>慢病毒表达质粒pwpI/H-F2A_L的构建将纯化回收的片段H-F2A-L，用DNA末端补平试剂盒补平两端；同时用PmeI酶切慢病毒表达质粒PWPI，经SAP去磷酸化后，用T4DNA连接酶与H-F2A-L连接，连接产物转化DH-5a感受态细菌，抽提质粒后用载体测序引物EFl a和重链下游引物gammal-B作PCR，筛选正向插入阳性克隆PWPI/H-F2A-L，并进行测序验证，即得；上述各引物为H-A(SEQ. ID. No. 4) :5，-CGC GGA TCC GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，gammal-B (SEQ. ID. No. 5) :5，_ATC GAT CGT CAT TTA CCC GGA GAC AGG GAG AG_3，L-A(SEQ. ID. No. 6) :5，-TGC ATG CAT GCC ACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATCCTC T-3，，Kappa-B (SEQ. ID. No. 7) :5，_GGG TCT AGT CTA ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT-3，:EFl a (SEQ. ID. No. 8) :5，-TCA AGC CTC AGA CAG TGG TTC-3，。口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus, FMDV)的多妝 2A 基因编码一种自剪切蛋白。两个外源基因之间以2A序列连接形成一个完整的ORF，翻译时融合蛋白可在编码2A区域的C端被2A切开，将融合蛋白切割分离为两个独立的蛋白，FMDV 2A短基因序列和2A高效的自剪切效率使之成为构建多顺反子载体的有效工具。Jianmin F.等人在腺相关病毒表达载体中利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种含F/2A序列的抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于该载体是PWPI/H-F2A-L,其中H和L分别是抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体重链基因和抗pl85eAB2人鼠嵌合抗体轻链基因，F2A是弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽。2.根据权利要求I所述的含F/2A序列的抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，其特征在于所述抗pl85eAB2人鼠嵌合抗体重链基因由鼠抗人pl85eAB2单抗重链可变区基因vH和人IgGl的重链恒定区基因Y I连接而成；所述抗pl85ertB2人鼠嵌合抗体轻链基因由鼠抗人pl85eAB2单抗轻链可变区基因vL和人IgGl的轻链恒定区基因K连接而成。3.根据权利要求I所述含F/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于用具有自我剪切能力的弗林蛋白酶Furin/ 口蹄疫病毒2A多肽F/2A连接人鼠嵌合抗体的重链和轻链，形成一个开放阅读框ORF，插入慢病毒表达载体pWPI，即得。4.根据权利要求3所述含F/2A序列的抗pl85 bB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤 〈1>抗pl85MbB2人鼠嵌合抗体重、轻链基因的扩增 用小量质粒抽提试剂盒抽提含有抗pl85OTbB2人鼠嵌合抗体轻、重链基因的质粒pWPI/H-IRES-L，并以此为模板，在DNA Taq酶作用下分别用H-A和gammal-B、L-A和Kappa-Β扩增出嵌合重链基因H和嵌合轻链基因L ;扩增条件为94°C预变性5min，94°C变性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35个循环，最后72°C延伸IOmin ;PGR产物经I %的琼脂糖凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收目的基因； <2>全长嵌合抗体H-F2A-L的构建 ①接头片段F2A的合成该片段由3部分构成含NsiI酶切位点的嵌合重链H的3’端序列、弗林蛋白酶和口蹄疫病毒2A自剪切多肽序列及含Pvu II酶切位点的嵌合轻链L的5’端序列； ②中间质粒PUC57/F2A的构建将接头片段F2A插入到pUC57质粒的BamHI和Xba I之间，获得中间质粒PUC57/F2A ； ③含有嵌合轻链的质粒pUC57/F2A-L的构建用BamHI和Xb...
【专利技术属性】
技术研发人员：李力，刘芳，张玮，
申请(专利权)人：广西壮族自治区肿瘤防治研究所，
类型：发明
国别省市：
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