本发明专利技术涉及一种利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，包括以下步骤：制备麻疯树外植体以及农杆菌液，外植体经农杆菌浸染后进行共培养；共培养后的外植体经脱菌后接入筛选培养基C13KC进行培养，从而获得抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转入分化培养基SR13KC，分化出抗性不定芽；以及将抗性不定芽转入生根培养基R2KC，从而获得转基因植株。利用本发明专利技术的方法，使利用农杆菌介导对麻疯树的遗传转化操作简便，价格低廉，为导入功能基因对麻疯树进行遗传改良，获得高产，高油，抗寒等新品种，奠定了良好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及麻疯树的组织培养
及基因工程领域，尤其是指利用卡那霉素作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法。
技术介绍
能源危机是当今世界面临的巨大挑战。中国的石油储量仅占全世界的2%，消费量却居世界第二，因此，迫切地需要寻找一种新型的能源来替代目前广泛使用的化石能源。与化石资源相比，种植能源植物获取生物柴油具有可再生的优势，是解决能源危机的根本途径。目前已发现的能源植物，主要集中在夹竹桃科、大戟科、萝摩科、菊科、桃金娘科以及豆科等。麻疯树OaioMa curcas L.)，又名小桐子、柴油树，为大戟科，麻疯树属，多年生落叶灌木或小乔木。小桐子种仁含油量高达61. 5%，可作为生产生物柴油的原料，是最有可能成为未来替代化石能源的树种，具有巨大的开发潜力。小桐子耐干旱贫瘠，分布于热带、 亚热带和雨量稀少、条件恶劣的干热河谷地区，主要分布于中国云南、贵州、四川、广东、广西、海南等地。植物转基因技术可将外源基因导入植物，定向改造植物性状而日益受到人们的重视。根癌农杆菌介导法是最常用的植物基因转化方法之一。根癌农杆菌含有Ti质粒，其上有一段T-DNA区，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中， 并且可通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。Ti质粒上含有另一个重要的区域，是Vir区，它编码实现质粒转移所需的蛋白质。我们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。然而，麻疯树的研究工作起步较晚，关于麻疯树组织培养和遗传转化技术的报道还很少。2010年，Pan等在African Journal of Biotechnology上发表文章，以卡那霉素作为筛选剂，利用农杆菌介导法对麻疯树进行转化。该方法是在筛选阶段不添加卡那霉素而获得转基因植株，然而120株再生植株只有1株生根，成功率太低而不具有实用性。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种，以便高效地获得转基因植株。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案一种，包括以下步骤步骤(1)，分别制备麻疯树外植体以及农杆菌菌液，再将外植体经农杆菌液浸染后进行共培养；步骤(2)，将共培养后的外植体脱菌后接入筛选培养基C13KC进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基C13KC是含有1. 0-3. Omg/L的6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的 3-吲哚丁酸、1-50 mg/L的卡那霉素以及50-200mg/L的特美汀的MS培养基；步骤(3)，将抗性愈伤组织转入分化培养基SR13KC进行培养，分化出抗性不定芽，所述分化培养基SR13KC是含有1. 0-3. Omg/L的6-苄基嘌呤、0. 25-1. Omg/L的3-吲哚丁酸、 l-50mg/L的卡那霉素以及50-200mg/L的特美汀的MS培养基；以及步骤(4)，将抗性不定芽转入生根培养基R2KC中进行培养，从而获得转基因植株，所述生根培养基R2KC是含有0. 1-1. Omg/L的3-吲哚丁酸，l_50mg/L的卡那霉素，50_200mg/L 的特美汀的1/2MS培养基。进一步地，步骤(1)中，共培养时采用C13A固体培养基，该C13A固体培养基是指含 1. 0-3. 0mg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸，50-200 μ M 乙酰丁香酮，20-30 g/L 蔗糖，7 g/L琼脂的MS培养基，pH 5. 8-6. 0。进一步地，步骤(1)中，麻疯树外植体的制备经由以下步骤挑选麻疯树种子经消毒后，取出完整的胚和子叶，接种于MS培养基培养萌发，获得子叶，切制成外植体，本步骤中采用的MS培养基含有20-30g/L蔗糖和7g/L琼脂，pH5. 8-6. 0。 进一步地，步骤(1)中，制备麻疯树外植体时，将完整的胚和子叶接种于MS培养基后先暗培养2-4天，再光照培养10-12天，种子即萌发，光照培养条件是温度23-26°C，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000 Ix0进一步地，步骤(1)中，准备农杆菌菌液、浸染及共培养的具体步骤为(a)挑取农杆菌的单克隆于含有抗生素的YEP液体培养基中J8°C，200rpm震荡培养 20-M小时，然后按照1 100的体积比转接，震荡培养至对数生长期，OD600=O. 8-1.0，将菌液转入50ml离心管，常温，4000rpm离心20分钟收集菌体，采用C13A液体培养基重新悬浮离心收集的农杆菌，调至0D_=0. 3-0. 震荡培养1-2个小时，获得农杆菌菌液备用， 采用的C13A液体培养基是指含有1. 0-3. 0mg/L 6-苄基嘌呤，0. 25-1. 0mg/L 3-吲哚丁酸， 50-200 μ M 乙酰丁香酮，20-30g/L 蔗糖的 MS 培养基，ρΗ5· 8-6. 0 ；(b)将切好的外植体放入容器中，加入准备好的菌液进行，置于摇床以不高于100转/ 分的速度震荡5-15分钟进行浸染；以及(c)取出浸染过的材料，将其置于无菌滤纸上吸除多余的菌液后再接入C13A固体培养基，置于23-26°C黑暗共培养2-4天。进一步地，步骤(2)进一步包括以下工艺步骤(a)取出共培养后的外植体，置于灭菌后的无菌吸水纸上，吸去菌液；(b)将吸去菌液的外植体接入筛选培养基CUKC进行培养，所述筛选培养基C13KC是指 MS培养基，含有1. 6-3. 0mg/L6-苄基嘌呤、0. 25-1. 0mg/L的3-吲哚丁酸、l_50mg/L卡那霉素、50-200mg/L特美汀、2-3%蔗糖及0. 7%琼脂，且ρΗ5· 8-6. 0 ；以及(c)置于23-26°C暗培养14-21天，获得抗性愈伤组织。进一步地，步骤(3)采用的分化培养基SR13KC是指MS培养基，其含有 0. 25-1. ang/L6-苄基嘌呤、0. 1-1. 0mg/L3_ 吲哚丁酸、0. 01-0. ang/L 赤霉素、l_50mg/L 卡那霉素、50-200mg/L特美汀、20_30g/L蔗糖以及7g/L琼脂，且pH5. 8-6. 0 ；接好的抗性愈伤组织在23-26°C，光照培养30-60天即可得到抗性不定芽，培养条件为，光照12-16小时/天， 光照强度1800-2000 Ix。进一步地，步骤(4)中，首先将抗性不定芽在0. 1-1. Omg/L的3_吲哚丁酸溶液中浸泡2-10分钟后，再接种到R2KC培养基进行生根培养，培养30-60天即可生根获得转基因植株，生根培养条件为2316°C，光照12-16小时/天，光照强度1800-2000 Ix0进一步地，所述生根培养基R2KC是含有0. 1-1. 0mg/L3-昭丨哚丁酸、l_50mg/L卡那霉素以及50-200mg/L特美汀的1/2MS培养基。进一步地，所述农杆菌携带有目的基因。本专利技术的有益效果如下本专利技术利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记，对麻疯树进行基因转化，以获得转基因植株，转化率可达1-5%左右(转基因植株数占外植体总数的比例)。因农杆菌介导的转化方法具转化的基因多为单拷贝，且有明确的边界序列，遗传稳定，多数符合孟德尔遗传规律，价格低廉等，为利用本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种利用卡那霉素抗性基因作为筛选标记对麻疯树进行基因转化的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤（１），分别制备麻疯树外植体以及农杆菌菌液，再将外植体经农杆菌液浸染后进行共培养；步骤（２），将共培养后的外植体脱菌后接入筛选培养基Ｃ１３ＫＣ进行培养，从而获得抗性愈伤组织，所述筛选培养基Ｃ１３ＫＣ是含有１．０－３．０ｍｇ／Ｌ的６－苄基嘌呤、０．２５－１．０ｍｇ／Ｌ的３－吲哚丁酸、１－５０ ｍｇ／Ｌ的卡那霉素以及５０－２００ｍｇ／Ｌ的特美汀的ＭＳ培养基；步骤（３），将抗性愈伤组织转入分化培养基ＳＲ１３ＫＣ进行培养，分化出抗性不定芽，所述分化培养基ＳＲ１３ＫＣ是含有１．０－３．０ｍｇ／Ｌ的６－苄基嘌呤、０．２５－１．０ｍｇ／Ｌ的３－吲哚丁酸、１－５０ｍｇ／Ｌ的卡那霉素以及５０－２００ｍｇ／Ｌ的特美汀的ＭＳ培养基；以及步骤（４），将抗性不定芽转入生根培养基Ｒ２ＫＣ中进行培养，从而获得转基因植株，所述生根培养基Ｒ２ＫＣ是含有０．１－１．０ｍｇ／Ｌ的３－吲哚丁酸，１－５０ｍｇ／Ｌ的卡那霉素，５０－２００ｍｇ／Ｌ的特美汀的１／２ＭＳ培养基。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王梅珍，孙怀娟，许文钊，潘文欢，李耿光，
申请(专利权)人：普罗米绿色能源深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：94
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