本发明专利技术是由一种萘啶霉素的生物合成基因簇，是链霉菌产生的具有抗肿瘤活性的四氢异喹啉生物碱家族类抗生素。整个基因簇共包含28个基因：6个非核糖体聚肽合成酶相关基因；4个前体分子β-羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸合成基因；4个特殊二碳起始单元生物合成基因；2个肽骨架环合相关基因；2个后修饰基因；2个调节基因；3个抗性基因；1个编码磷酸泛酰巯基乙胺转移酶相关基因；4个功能不确定的基因。通过对上述生物合成基因的遗传操作可阻断萘啶霉素的生物合成或产生结构类似物。该基因簇可用于四氢异喹啉生物碱家族化合物的基因工程、蛋白表达、酶催化反应等，也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗肿瘤抗生素萘啶霉素的生物合成基因簇，基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
技术介绍
四氢异喹啉生物碱是一类结构复杂而独特的天然产物家族，均具有良好的抗菌和抗肿瘤活性。1974年，加拿大科学家Klu印fel等人从复活岛土壤中分离得到一种具有良好抗肿瘤活性的天然产物；并且，通过菌种分离发现，它是由土壤中的一种葡萄牙链霉菌(Streptomyces lusitanus AYB-1026)所产生的次级代谢产物。由于其良好的抗菌活性，Sygusch等人通过发酵的方法分离纯化得到了这种天然产物， 常温下它是一种宝石红的晶体。通过X-ray晶体衍射分析的方法Sygusch首次确定了这种天然产物的化学结构，并把它命名为Naphthyridinomycin-萘唳霉素。1994年,Lederle实验室又从Streptomyces viridostaticus ssp Iitoralis的发酵液中分离得到了萘唳霉素的四种结构类似物bioxalomycins(a i，a 2，β 17 β 2,图I),它们均表现出良好的生物活性。研究表明萘啶霉素类生物碱是一种很好DNA烷基化试剂或交联剂，它们在较低的浓度 (约O. 2 μ g/mL)下就能够很大程度地抑制DNA合成，在一定浓度下也能够抑制RNA和蛋白质的合成。基于前人的研究，Willams和Herberich的实验结果揭示出bioxalomycin a2实际上在双链的DNA之间可以形成了一个双链DNA交联。到2000年，生物学家又分离得到了一系列与之结构类似的化合物，统称为四氢异喹啉家族；这些化合物都是以苯醌并环和芳并环为基本核心骨架结构。根据结构上的细微的差异，这几十个结构相似的化合物被分作了三个家族=Naphthyridinomycins家族， Saframycins 家方矣和 Quinocarcins 家方矣。前体标记实验表明萘啶霉素腈基取代物的并环骨架主要来自于三种氨基酸一 L-tyrosine (酪氨酸)，D、L-ornithine (鸟氨酸)，glycine (甘氨酸):其中苯醌的六元环来自一个L-tyrosine (实际上,酪氨酸首先是由L-methionine 甲基化，再经过一步氧化还原反应实现间位的羟化)，边上的两个六元环来自于一个鸟氨酸，而上面的五员环来则自于由两个甘氨酸缩合得到的serine (丝氨酸)，0_、C-、N-的甲基均来自于L-methionine (甲硫氨酸)。目前，一个来源于加勒比海的一种海鞘(Ecteinascidia turbinate)中的四氢异喹啉天然产物Et 743(见图I)引起了广大生物学家的关注。该化合物体外活性LC5tl <1ρΜ， ID50O. 2-0. 6nM，活性比抗肿瘤药物紫杉醇高约50倍。作为西班牙生物技术公司PharmaMar(Zeltia)主导的抗癌药,ET-743在欧洲的上市申请已获得批准，主要用来治疗经传统化疗治疗无效的晚期软组织肉瘤患者。而在美国和其它国家， PharmaMar已将ET-743的研发和商业开发权授让给Johnson&Johnson。由于ET-743已被欧盟承认为治疗软组织肉瘤的罕用药物，PharmaMar认为该药的全球年销售额将达10亿美元。目前该药还处于治疗乳腺癌、直肠癌、非小细胞肺癌和子宫内膜癌、黑色素瘤、骨肉瘤、间皮瘤的II期试验和卵巢癌的III期试验。作为一种具有良好临床应用前景的抗肿瘤药物，Et 743来源十分有限。据统计， 从I吨海鞘中只能获得Ig Et 743，不能满足临床科学研究的需要。有人用培养海鞘细胞的方法获得Et 743，但是其海洋来源使得研究非常困难。目前临床研究所用Et 743主要来源于突光假单孢菌Pseudomonas fluorescens A2-2发酵产生的番红菌素B (safracin, SAC-B)的氰化衍生物经21步化学半合成得到。萘啶霉素与Et 743边链和骨架结构有一定的相似，而且其宿主菌是链霉菌，可以通过发酵的方法来获得代谢产物。我们以微生物来源的萘啶霉素为目标分子，从克隆生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，阐明生物合成机理，通过代谢工程改造生产Et 743或其类似物进而结合化学半合成生成Et 743或类似物，为新活性“非天然”天然产物的发现和药物开发提供分子和活性多样性。
技术实现思路
本专利技术涉及一种链霉菌Streptomyces lusitanus NRRL8034产生的四氢异喹啉生物碱家族中具有抗肿瘤活性抗生素-萘唳霉素(Naphthyridinomycin, NPT)的生物合成基因簇，该基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。抗肿瘤活性的抗生素-萘啶霉素的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. I所示。本专利技术中整个基因簇共包含28个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中 6个(NapH、NapJ, NapL, NapM, NapN, NapO)用于编码非核糖体聚肽合成酶(NRPS)，共包含 8个模块，21个功能域，负责催化萘啶霉素聚肽链的生物合成；4个基因(NapB、NapC、NapD、 NapE)编码的蛋白负责催化二碳起始单元的合成与延伸；4个基因(NapQ、NapS、NapT、NapI) 编码的蛋白负责催化前体分子β -羟基-3-羟基-5-甲基-O-甲基-酪氨酸的生物合成； 4个基因(NapA、NapU、NapW、NapV)编码的甲基化酶和氧化还原酶催化分子骨架的进一步修饰；1个基因NapX编码的Sfp型磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTase)特异性地活化独特的ACP-NapC ;还包括 2 个调节基因(NapR3、NapR5)、3 个抗性基因(NapRl、NapR2、NapR4)及4个功能不确定的基因(NapF、NapG> NapK> NapP)。本专利技术还提供了一个编码紫外修复蛋白的核苷酸序列，由序列12中的氨基酸序列组成，命名为NapRl，其基因的核苷酸序列位于序列I中第9795. . 12287碱基处。本专利技术还提供了一个编码整合膜蛋白的核苷酸序列，由序列13中的氨基酸序列组成，命名为NapR2，其基因的核苷酸序列位于序列I中第13593. . 12328碱基处。本专利技术还提供了一个编码FAD依赖的单氧化酶的核苷酸序列，由序列14中的氨基酸序列组成，命名为NapA，其基因的核苷酸序列位于序列I中第15084. . 13606碱基处。本专利技术还提供了一个编码丙酮酸脱氢酶α亚基的核苷酸序列，由序列15中的氨基酸序列组成，命名为NapB，其基因的核苷酸序列位于序列I中第15380. . 16396碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基载体蛋白的核苷酸序列，由序列16中的氨基酸序列组成，命名为NapC，其基因的核苷酸序列位于序列I中第16384. . 16641碱基处。本专利技术还提供了一个N端编码丙酮酸脱氢酶β亚基、C端编码丙酮酸脱氢酶系Ε2亚单位的核苷酸序列，由序列17中的氨基酸序列组成，命名为NapD，其基因的核苷酸序列位于序列I中第16638. . 18812碱基处。本专利技术还提供了一本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐功利，彭超，浦津越，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：
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