本发明专利技术涉及一种高效诱导桉树离体茎段不定芽再生的方法，包括：培养无菌外植体步骤，对桉树杂交品种的带腋芽茎段依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段后接种到B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养再弱光照培养，形成愈伤组织；芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，每隔14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养，使愈伤组织分化不定芽。本发明专利技术以桉树白化苗茎段为无菌外植体，经愈伤组织诱导和芽诱导分化出不定芽，可用于DH32-29及其它优良杂交种无性系，高效稳定，再生效率高于70%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物组织培养育苗
，尤其涉及一种。
技术介绍
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)桉属(Eucalyptus)植物的统称。广泛分布于亚洲、 南美洲和欧洲的一些地区，全球种植面积达二千万多公顷。桉树品种多，包括杂交品种有 700多种，在这些品种当中有些品种具有重要的经济价值，如可作为纸浆、木材、纤维板材以及提取单宁和精油等原材料。桉树具有速生，丰产，适应性强，生产周期短，收获后多发芽再生等优点。目前已被多个国家和地区广泛种植。桉树人工林面具约占世界人工林总面积的三分之一。因此桉树具有广泛的开发利用价值。由于林木生长周期长，遗传杂合性高，许多性状属于多基因控制的数量性状，传统的常规育种手段难以满足定向培育桉树新品种的要求。因此人们希望利用新兴的基因工程技术来解决桉树常规育种难以解决的问题，定向地培育出经济价值高的性状。基因工程育种是以现代分子生物学技术为基础，将目的基因通过体外重组导入受体细胞，然后再生出完整植株以培育出新品种的一种技术手段。它具有高效性和针对性，可弥补常规育种技术的不足，可以加速优质、高产、抗逆性强等桉树新品种的选育。目前，桉树再生率低，实验材料主要以种子为基础，变异较大，很大程度上制约了桉树转基因技术的进展，完善的植物转化受体系统依赖于高效稳定的再生能力和稳定的外植体来源。对于广泛栽培的DH3249等杂交优良无性系，实现转基因育种，筛选出优良的转基因株系，寻求高效稳定的再生率成为急需解决的技术难题。
技术实现思路
本专利技术实施例所要解决的技术问题在于，提供一种，以便快速、高效、稳定地繁殖并选育优良品种。为解决上述技术问题，本专利技术提供如下技术方案一种，包括如下步骤培养无菌外植体步骤，以2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料，依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段成合适的长度，接种到含0. 05-2. Omg/L N- (2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、0. 01-0. lmg/L萘乙酸、10_500mg/L腐胺和l_50mg/L亚精胺的B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养5-15天，再弱光照培养5-20天，形成愈伤组织； 芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，且每隔 14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养14-100天，使愈伤组织分化不定芽，所述芽诱导分化培养基是含有10-40mg/L腐胺，0. 5-3. Omg/L亚精胺的B5培养基。进一步地，培养无菌外植体步骤中，所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒，并用无菌水冲洗。进一步地，腋芽萌发培养子步骤中，采用的培养基是MS培养基，培养条件是温度 22-30°C，无光照。进一步地，丛生芽培养子步骤中，采用的培养基是含0. 1-2. Omg/L细胞分裂素和 0. 01-1. Omg/L生长素的MS培养基，培养条件是诱导培养21- 天，光照12-18小时/天， 光照强度 1500-100001x，温度 22-30°C。进一步地，生根苗培养子步骤中，采用的培养基是含0. 1-1. Omg/L生长素的1/2MS 培养基，生根诱导培养的条件是，诱导培养15-30天，光照12-18小时/天，光照强度 1500-100001x，温度 22-30°C。 进一步地，白化苗培养子步骤中，采用的培养基是含蔗糖30-100g/L的B5培养基， 培养条件是暗培养14-35天，温度22-30°C。进一步地，愈伤组织的诱导步骤中，外植体的切段长度为2-10mm，培养时温度 22-300C ；弱光照培养时，光照12-18小时/天，光照强度20_2001x，22_30°C。进一步地，芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述芽诱导分化培养基还含有 0. 2-2. Omg/L细胞分裂素，0. 05-0. 5mg/L生长素，培养条件是光照12-18小时/天，光照强度 500-30001x，温度 22-30°C。进一步地，所述丛生芽培养子步骤以及芽诱导培养分化不定芽步骤中，所述细胞分裂素为6-苄基嘌呤，生长素为萘乙酸；而生根苗培养子步骤中使用的生长素为3-吲哚丁酸。通过采用上述技术方案，本专利技术至少具有如下有益效果本专利技术利用桉树白化苗的茎段为无菌外植体，经愈伤组织诱导和芽诱导途径诱导出不定芽，可以应用于DH32-29 及其它优良杂交种无性系，具有高效稳定的特点，再生效率可达70%以上，为利用现代分子育种技术对桉树的遗传改良奠定了良好的基础，可以用于目的基因导入受体细胞等基因工程，具有十分重要的经济价值。具体实施例方式下面结合实例详述描述本专利技术的实施方案。需要说明的是，下述实例是说明性的， 不是限定性的，不能以下述实例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术提供一种，包括如下步骤51、培养无菌外植体步骤，以2-4年生桉树杂交品种的带腋芽茎段为培养原材料，依次进行消毒子步骤、腋芽萌发培养子步骤、丛生芽培养子步骤、生根苗培养子步骤及白化苗培养子步骤，获得白化苗作为无菌外植体；52、愈伤组织的诱导步骤，将无菌外植体切段成合适的长度，接种到含0.05-2. Omg/L N- (2-氯-4-吡啶基)-N-苯基脲、0. 01-0. lmg/L萘乙酸、10_500mg/L腐胺和l_50mg/L亚精胺的B5培养基上进行愈伤诱导，先暗培养5-15天，再弱光照培养5-20天，形成愈伤组织；53、芽诱导培养分化不定芽步骤，将愈伤组织转移到芽诱导分化培养基上培养，且每隔 14-25天转移到成分相同的芽诱导分化培养基上继代培养14-100天，使愈伤组织分化不定芽，所述芽诱导分化培养基是含有10-40mg/L腐胺，0. 5-3. 0mg/L亚精胺的B5培养基。其中，培养无菌外植体步骤主要包括如下子步骤Si. 1、消毒子步骤，所述消毒处理是采用酒精和升汞对培养原材料进行泡洗消毒，并用无菌水冲洗，具体可采用如下处理先以体积百分比70%乙醇浸泡20秒，再以无菌水冲洗2 次；然后，以质量百分比0. 1%升汞浸泡5分钟，再倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次；然后，再修剪成0. 5-1. Ocm长的带腋芽的茎段，以质量百分比0. 1%升汞浸泡2分钟，倒出升汞，用无菌水冲洗4-6次。由于，对培养原材料的消毒处理在本领域中已经是相当成熟的技术手段， 本专利技术可以直接采用本领域中现有的各种有效消毒处理手段，对于实施效果并不会产生实质性的影响。Si. 2、腋芽萌发培养子步骤中，采用的培养基是MS培养基，培养条件是温度 22-30°C，无光照。Si. 3、丛生芽培养子步骤中，采用的培养基是含0. 1-2. Omg/L细胞分裂素和 0. 01-1. Omg/L生长素的MS培养基，所述细胞分裂素优选为6-苄基嘌呤，生长素优选为萘乙酸，培养条件是诱导培养21- 天，光照12-18小时/天，光照强度1500-100001χ，温度 22-30 "C。Si. 4、生根苗培养子步骤中，采用的培养基是含0. 1-1. Omg/L生长素的1/2MS培养基，本子步骤中，所述生长素为3-吲哚丁酸，生根诱导培养的条件是，诱导培养15-30天，光照12-18小时/天，光照强度1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙长斌，郭棣，江淑珍，陈方，孟丽娜，张兰英，
申请(专利权)人：普罗米绿色能源深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：
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