本发明专利技术公开了一种由链霉菌Streptomyces?sp.TP-A2060产生的谷田霉素的生物合成基因簇。整个基因簇共包含31个基因：8个骨架合成相关基因；2个甲基转移酶基因；10个氧化还原酶及辅基蛋白基因；3个未知功能酶基因；3个调节基因；5个抗性基因。通过对上述生物合成基因簇的遗传操作可阻断谷田霉素的合成，一个氧化还原酶基因ytkT的替换可以产生中间体化合物，两个基因ytkJ和ytkK表达的蛋白经分离纯化可以得到可溶蛋白。本发明专利技术所提供的基因也可用于寻找和发现用于医药、工业或农业的化合物或基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物基因资源和基因工程领域，具体涉及抗真菌、抗肿瘤抗生素谷田霉素的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其应用。
技术介绍
谷田霉素(Yatakemycin)是日本Toyama大学的科学家Igarashi等于2003年在进行新型抗真菌化合物筛选时由链霉菌(Sti^ptomyces sp. TP-A0365)发酵培养基中分离出的微生物次级代谢产物[J Antibiot (2003) 56，107-113]。经NMR和CID-MS/MS实验最初分析结构证明其属于一类新型的抗生素家族。此家族中的化合物被认为是DNA烷基化试剂，包括CC-1065，多卡霉素A(duocarmycinA)，多卡霉素SA (duocarmycinSA)，他们最明显的特征是吡咯吲哚环上的环丙基结构。2004年美国Scripps研究所的Dale L. Boger小组首次发表了对(+)_谷田霉素的全合成工作并确定了其结构[J Am Chem Soc (2004) 126, 8396-8398]。实验显示，谷田霉素可以抑制致病真菌如曲霉，烟曲霉，黄曲霉，白色念珠球菌，新型隐球菌的生长。其最小抑菌浓度(MIC)值为0.01 0.03 μ g/mL，是两性霉素 (amphotericinB/MIC :0. 1 0. 5 μ g/mL)禾口伊曲康唾(itraconazole/MIC :0. 03 0. 2 μ g/ mL)的10 100倍。另外，它表现出对肿瘤细胞极强的毒性，比另一种烷基化抗肿瘤药物丝裂霉素对肿瘤细胞的毒性高1000倍[J Am Chem Soc (2003) 125，10971-10976]。最近的研究表明该家族化合物不仅可以对游离DNA双螺旋发生烷基化修饰，还可以高效地对核小体颗粒(nucleosome core particles)中的DNA进行烷基化修饰，甚至是几乎全部组蛋白包围的DNA，因此这类化合物为研究真核细胞染色体中DNA-组蛋白的动力学识别及DNA损伤导致的生物效应提供了有力的工具[Nature Chem Biol Q006) 2，64-66]。谷田霉素与DNA烷基化作用的机制是腺嘌呤中3位的N亲核进攻谷田霉素环丙基上取代最少的碳原子，形成对DNA的烷基化物。其对DNA的烷基化位点都是腺嘌呤，没有检测到鸟嘌呤的参与。经试验发现DNA链中所有N-3位被烷基化的腺嘌呤旁侧碱基都是A 或 T[J Am Chem Soc (2006) 128,7136-7137 JAm Chem Soc (2006) 128,15683-15696] 谷田霉素的抗真菌和细胞毒性活性来自于其独特的化学结构。其骨架部分是由一个吲哚与两个吡咯吲哚环通过两个酰胺键连接构成，与家族系列化合物相比，除共有的中间吡咯吲哚环上的环丙基外，其分子左侧吡咯吲哚环上独特的硫酯键也是谷田霉素引人关注的重点。由于结构上的特点，谷田霉素及其家族化合物被形象的称作“三明治”结构系列化合物。我们以微生物来源的谷田霉素为目标分子，从克隆其在链霉菌Mi^ptomyces sp. TP-A2060生物合成基因簇出发，采用微生物学、分子生物学、生物化学及有机化学相结合的方法研究其生物合成，通过体内基因操作的方法初步对其生物合成机制的研究揭示包括环丙基在内的独特化学结构形成的酶学机理，在此基础上运用代谢工程的原理，合理修饰谷田霉素的生物合成途径，探索结构稳定、活性更好、并能通过微生物发酵大量生产的新型药物。
技术实现思路
本专利技术涉及一种由链霉菌Mi^ptomyces sp. TP-A2060产生的具有抗真菌、抗肿瘤活性的DNA烷基化抗生素一谷田霉素的生物合成基因簇的克隆、测序、分析、功能研究及其应用。本专利技术中整个基因簇共包含31个基因的核苷酸序列或互补序列(序列1)，其中8 个基因(ytkD，ytkF，ytkG，ytkJ，ytkL，ytkN，ytkQ，ytkV)用于编码骨架合成相关蛋白；2个基因(ytkU，ytkff)用于编码甲基转移酶；10 个基因(ytkA，ytkB, ytkC, ytkH，ytkl, ytkK， ytkM, ytkO, ytkS，ytkT)用于编码氧化还原酶及辅因子；3个基因(ytkE，ytkP，ytkX)用于编码未知功能酶；3个基因(ytkRl，ytkR7，ytkR8)用于编码调节蛋白；5个基因(ytkR2， ytkR3, ytkR4，ytkR5，ytkR6)用于编码抗性相关蛋白。本专利技术还提供了一个编码黄嘌呤脱氢酶含钼蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列2中，命名为ytkA，其基因的核苷酸序列位于序列1中第4567-6774个碱基处。本专利技术还提供了一个编码含钼脱氢酶黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)结合蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列3中，命名为ytkB，其基因的核苷酸序列位于序列 1中第6771-7760个碱基处。本专利技术还提供了一个编码氧化还原酶铁硫簇结合亚基的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列4中，命名为ytkC，其基因的核苷酸序列位于序列1中第7747-8265个碱基处。本专利技术还提供了一个编码酰基转移酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列5中，命名为ytkD，其基因的核苷酸序列位于序列1中第8468-9049个碱基处。本专利技术还提供了一个编码未知蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列 6中，命名为ytkE，其基因的核苷酸序列位于序列1中第9238-10188个碱基处。本专利技术还提供了一个编码乙酰辅酶A(CoA)转移酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列7中，命名为ytkF，其基因的核苷酸序列位于序列1中第10525-12384个碱基处。本专利技术还提供了一个编码转录调节因子的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列8中，命名为ytkRl，其基因的核苷酸序列位于序列1中第1M57-13095个碱基处。本专利技术还提供了一个编码腺嘌呤单磷酸(AMP)-连接酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列9中，命名为ytkG，其基因的核苷酸序列位于序列1中第13055-14686 个碱基处。本专利技术还提供了一个编码DNA烷基化修复蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列10中，命名为ytkR2，其基因的核苷酸序列位于序列1中第14719-1M74个碱基处。本专利技术还提供了一个编码依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的黄素单核苷酸(FMN)还原酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列11中，命名为ytkH，其基因的核苷酸序列位于序列1中第1M97-16093个碱基处。本专利技术还提供了一个编码铁氧化还原蛋白的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位4于序列12中，命名为ytkl，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16093-16320个碱基处。本专利技术还提供了一个编码水解酶/磷酸转移酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列13中，命名为ytkR3，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16320-16961个碱基处。本专利技术还提供了一个编码脱氧核糖核酸酶的核苷酸序列，其编码的氨基酸序列位于序列14中，命名为ytkR4，其基因的核苷酸序列位于序列1中第16969-17865个碱基处。本专利技术还提供了一个编码核酸内切酶的核苷酸序列本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种谷田霉素的生物合成基因簇，该基因簇核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示，其中编码谷田霉素生物合成所涉及的３１个基因，包括ｙｔｋＤ，ｙｔｋＦ，ｙｔｋＧ，ｙｔｋＪ，ｙｔｋＬ，ｙｔｋＮ，ｙｔｋＱ，ｙｔｋＶ８个骨架合成相关基因；ｙｔｋＵ，ｙｔｋＷ共２个甲基转移酶基因；ｙｔｋＡ，ｙｔｋＢ，ｙｔｋＣ，ｙｔｋＨ，ｙｔｋＩ，ｙｔｋＫ，ｙｔｋＭ，ｙｔｋＯ，ｙｔｋＳ，ｙｔｋＴ共１０个氧化还原酶及辅基蛋白基因；ｙｔｋＥ，ｙｔｋＰ，ｙｔｋＸ共３个未知功能酶基因；ｙｔｋＲ１，ｙｔｋＲ７，ｙｔｋＲ８共３个调节基因；ｙｔｋＲ２，ｙｔｋＲ３，ｙｔｋＲ４，ｙｔｋＲ５，ｙｔｋＲ６共５个抗性基因。
【技术特征摘要】
1.一种谷田霉素的生物合成基因簇，该基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中编码谷田霉素生物合成所涉及的31个基因，包括ytkD，ytkF，ytkG，ytkj, ytkL, ytkN, ytkQ, ytkV8个骨架合成相关基因；ytkU，ytkW共2个甲基转移酶基因；ytkA，ytkB, ytkC, ytkH， ytkl, ytkK，ytkM，ytkO, ytkS，ytkT 共 10 个氧化还原酶及辅基蛋白基因；ytkE, ytkP，ytkX 共3个未知功能酶基因；ytkRl，ytkR7，ytkR8共3个调节基因；ytkR2，ytkR3，ytkR4，ytkR5, ytkR6共5个抗性基因。2.一种根据权利要求1所述的谷田霉素的生物合成基因簇的用途...
【专利技术属性】
技术研发人员：唐功利，黄伟，李燕，张凤，徐慧，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，
类型：发明
国别省市：31
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