本发明专利技术公开了两种TNF‑α蛋白纳米抗体的序列，它主要通过噬菌体展示技术，获得了TNF‑α蛋白纳米抗体序列，并通过生物素化纳米抗体，建立了双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法，从而来定量检测样品中TNF‑α的含量。具体的操作方法是：在ELISA板中，首先包被TNF‑α蛋白纳米抗体，然后加入待测的样品或梯度稀释的TNF‑α标准蛋白，接着加入生物素化的TNF‑α蛋白纳米抗体2和HRP标记的链霉亲和素，最后用显色底物显色，在波长620nm处测光吸收值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于纳米抗体
，具体涉及一种TNF-α蛋白纳米抗体及其编码序列及应用。
技术介绍
肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-alphaTNF-α)又称为恶质素，它主要是由活化的单核巨噬细胞分泌的一种细胞因子。淋巴细胞、成纤维细胞、肥大细胞等在一定的情况下也可以分泌肿瘤坏死因子-α。TNF-α基因位于人的第6号染色体短臂的6p21.1和6p21.3之间,与主要组织相容性抗原复合体III类基因(MHC-III)紧密连锁。成熟的TNF-α蛋白是由157个氨基酸组成的，分子量大小为17KD，没有糖基化修饰，其氨基酸序列上的69和101位的半胱氨酸会形成分子间的二硫键。每个TNF-α单体由反向平行的β-折叠组成,主要以二聚体、三聚体或五聚体的形式存在于生物体内，其中同源的三聚体具有生物学活性。当体内TNF-α同源三聚体的浓度低于纳摩尔时，同源三聚体会发生解离，从而失去生物学活性。TNF-α蛋白具有多种生物学功能，在生物体内的炎症反应和免疫调节中起重要作用。TNF-α可以使免疫细胞活化、促进增殖和分化等,参与抵抗细菌、病毒和寄生虫的感染。TNF-α参与机体的多种病理过程，可以促进组织的修复，引起肿瘤细胞的凋亡，是直接杀伤肿瘤细胞最有效的细胞因子之一，同时也是维持机体内环境平衡、抵御各种致病因子不可或缺的免疫调节因子。TNF-α的异常表达，除可以导致类风湿性关节炎以外，还可以导致很多其他的自身免疫性疾病，例如：克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊椎炎、牛皮癣、炎性肠病、哮喘病、过敏性鼻炎、系统性红斑狼疮、硬皮病等。研究结果表明，在这些病人的血清中，TNF-a水平较常人升高，因此检测TNF-α水平，对于这些疾病的临床诊断、封闭性治疗以及预后具有很重要的意义。1993年比利时的HamersCasterman报道了在骆驼血清中不仅存在由2条H链和2条L链构成的IgG1型常规抗体，还存在缺失轻链的IgG2和IgG3亚型的重链抗体(heavy-chainantibody，hcAb)这类抗体的抗原结合位点仅由重链的可变区VHH(variabledomainoftheheavychainofHCAbs,VHH)单结构域形成，尽管天然缺失轻链可变区，却仍具有良好和广泛的抗原结合力。由于其在可变区，框架FR2区存在一些不同于常规抗体的亲水性氨基酸，使得VHH抗体在水溶液中具有良好的稳定性。VHH抗体是目前所发现的具有完整功能的最小分子抗体片段，分子量为15kDa，仅为常规抗体的1/10，其分子高度4.8nm，直径2.2nm，故被称为单域抗体或纳米抗体(nanobody)。纳米抗体重要的特征之一是其具有更为伸展的抗原互补结合区(CDR)，可结合一些常规抗体无法接近的抗原表位。如位于酶蛋白裂隙中的活性中心结构。纳米抗体还具有易表达，水溶性好，稳定性强，免疫原性弱，组织穿透性好等优点，使得该抗体作为一种小型化的基因工程抗体在基础研究、药物开发等领域有广阔的应用前景。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种表达量高、易于放大生产、成本低的TNF-α纳米抗体来检测TNF-α蛋白的方法，以避免现有技术的检测方法的放射性污染。本专利技术还要解决的技术问题是，提供上述TNF-α蛋白纳米抗体的制备方法。本专利技术最后要解决的技术问题是，提供上述TNF-α蛋白纳米抗体在检测TNF-α蛋白中的应用。为解决上述技术问题，本专利技术提供了：一种TNF-α蛋白纳米抗体，所述TNF-α蛋白纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区：其中，所述的框架区包括以下4段氨基酸序列:如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述的互补决定去包括以下3段氨基酸序列：如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3；或者，所述的框架区包括以下4段氨基酸序列:如SEQIDNO.8所示的FR1，如SEQIDNO.9所示的FR2，如SEQIDNO.10所示的FR3，如SEQIDNO.11所示的FR4；所述的互补决定去包括以下3段氨基酸序列：如SEQIDNO.12所示的CDR1，如SEQIDNO.13所示的CDR2，如SEQIDNO.14所示的CDR3。一种TNF-α蛋白纳米抗体，TNF-α蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.15或者SEQIDNO.16所示。一种编码TNF-α蛋白纳米抗体的基因，该核苷酸序列如SEQIDNO.17或者SEQIDNO.18所示。一种重组质粒，该重组质粒中包含SEQIDNO.17或者SEQIDNO.18所示的核苷酸序列。一种重组细胞，该重组细胞中包含SEQIDNO.17或者SEQIDNO.18所示的核苷酸序列。上述TNF-α蛋白纳米抗体的制备方法，包括如下步骤：(1)将SEQIDNO.17或者SEQIDNO.18所示的核苷酸序列克隆至表达载体中，得到重组质粒，将重组质粒转化宿主细胞，诱导表达TNF-α蛋白纳米抗体；(2)从宿主细胞中纯化TNF-α蛋白纳米抗体。步骤(1)中，所述的载体为pET28a。步骤(1)中，所述的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。上述TNF-α蛋白纳米抗体在检测TNF-α蛋白中的应用。将TNF-α蛋白纳米抗体1作为包被抗体，用包被缓冲液(50mmol/L的Na2C03-NaHCO3pH＝9.6)稀释至5ug/ml，ELISA板每孔加200ul，4℃包被过夜。TBST洗ELISA板3次，加入0.5％BSA封闭液，室温封闭一小时。丢弃封闭液并用TBST洗3次，对照孔中加入梯度稀释的TNF-α标准蛋白，实验孔中加入待测血清样品，室温孵育一小时。TBST洗板3次，每孔加入200ul稀释的生物素化的TNF-α蛋白纳米抗体2，室温孵育一小时。TBST洗板3次后，加入HRP标记的链霉亲合素，200μl/孔，室温孵育一小时。TBST洗板3次，每孔加入100ul的显色液，室温避光反应20分钟，ELISA板置于酶标仪上，测620nm吸光值。以TNF-α标准蛋白的相应浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，作标准曲线。根据待测样品的吸光值，经曲线拟合并计算，即可得出待测样品中TNF-α蛋白浓度。有益效果：本专利技术具有如下突出的效果：本专利技术通过噬菌体展示技术，获得了两种TNF-α蛋白纳米抗体序列，并通过生物素化纳米抗体，建立了双抗体夹心酶联免疫吸附试验的方法。本专利技术用来进行TNF-α蛋白的定量检测具有：高特异性、便于生产等优点附图说明图1是TNF-α蛋白原核表达SDS-PAGE电泳图：M为蛋白分子标准；1为23℃、16h、0.1mmol/LIPTG诱导全菌；2为37℃、4h、1mmol/LIPTG诱导全菌；3、4分别为23℃、37℃诱导菌超声破碎上清；5、6分别为23℃、37℃诱导菌超声破碎沉淀。图2是TNF-α蛋白镍柱亲和层析SDS-PAGE电泳图：1为TNF-α表达菌的诱导后裂解液，2为TNF-α表达菌超声破碎沉淀，3为TNF-α表达菌超声破碎上清，4～5为流穿液，6～9为目的蛋白洗脱液图3是nest-PCR1产物琼脂糖凝胶电泳图：M为DNA分子标准；1为ne本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种TNF‑α蛋白纳米抗体，其特征在于，所述TNF‑α蛋白纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区：其中，所述的框架区包括以下4段氨基酸序列:如SEQ ID NO.1所示的FR1，如SEQ ID NO.2所示的FR2，如SEQ ID NO.3所示的FR3，如SEQ ID NO.4所示的FR4；所述的互补决定去包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO.5所示的CDR1，如SEQ ID NO.6所示的CDR2，如SEQ ID NO.7所示的CDR3；或者，所述的框架区包括以下4段氨基酸序列:如SEQ ID NO.8所示的FR1，如SEQ ID NO.9所示的FR2，如SEQ ID NO.10所示的FR3，如SEQ ID NO.11所示的FR4；所述的互补决定去包括以下3段氨基酸序列：如SEQ ID NO.12所示的CDR1，如SEQ ID NO.13所示的CDR2，如SEQ ID NO.14所示的CDR3。
【技术特征摘要】
1.一种TNF-α蛋白纳米抗体，其特征在于，所述TNF-α蛋白纳米抗体的VHH链包括框架区和互补决定区：其中，所述的框架区包括以下4段氨基酸序列:如SEQIDNO.1所示的FR1，如SEQIDNO.2所示的FR2，如SEQIDNO.3所示的FR3，如SEQIDNO.4所示的FR4；所述的互补决定去包括以下3段氨基酸序列：如SEQIDNO.5所示的CDR1，如SEQIDNO.6所示的CDR2，如SEQIDNO.7所示的CDR3；或者，所述的框架区包括以下4段氨基酸序列:如SEQIDNO.8所示的FR1，如SEQIDNO.9所示的FR2，如SEQIDNO.10所示的FR3，如SEQIDNO.11所示的FR4；所述的互补决定去包括以下3段氨基酸序列：如SEQIDNO.12所示的CDR1，如SEQIDNO.13所示的CDR2，如SEQIDNO.14所示的CDR3。2.一种TNF-α蛋白纳米抗体，其特征在于，TNF-α蛋白纳米抗体的氨基酸序列如SEQIDNO.15或者SEQIDNO.16所示。3.一种编码TNF-α蛋白纳米抗体的基因，其特征在于，该核苷酸序列如SEQIDNO.17或者SEQIDNO.18所示。4.一种重组质粒...
【专利技术属性】
技术研发人员：李淑锋，单海涛，姜昆鹏，华子春，
申请(专利权)人：东南大学，南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。