一种针对PI3K的纳米抗体及其临床应用制造技术

本发明专利技术公开了一种PI3K的纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，公开了框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列和互补决定区CDR氨基酸序列，本发明专利技术还公开了一种PI3K纳米抗体，还公开了一种DNA分子，它编码本发明专利技术所述的PI3K的纳米抗体的VHH链或本发明专利技术所述的PI3K纳米抗体，还公开了一种宿主细胞，它可以表达PI3K的纳米抗体，还公开了该PI3K纳米抗体用于检测PI3K的用途。通过本发明专利技术所公布的纳米抗体基因序列及宿主细胞，该纳米抗体能够在大肠杆菌内高效表达，应用于PI3K检测试剂及生物制药的研发。

【技术实现步骤摘要】
一种针对PI3K的纳米抗体及其临床应用
本专利技术属于生物医学或生物制药
，涉及针对于PI3K的纳米抗体及其编码序列。
技术介绍
1993年比利时科学家Hamers.R在骆驼体内发现，与传统抗体相比，在骆驼血液中的抗体，有一半没有轻链，只包含一个重链可变区（VHH）和两个常规的CH2与CH3区，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。克隆该重链抗体的可变区得到最小的抗原结合片段，即纳米抗体（Nanobody，Nb）。纳米抗体的单域性质使其较普通抗体具有以下独特性能：1）分子量小，可穿透血脑屏障，较易作用于病灶区；2）在原核或者真核系统中可高表达；3）特异性强、亲和力高；4）高耐热性和化学稳定性；5）对人的免疫原性弱。其在肿瘤、感染性疾病、肠炎、淀粉样变疾病、血栓以及动脉粥样硬化病变的诊断和治疗方面具有良好的应用效果，同时可以显著降低成本。纳米抗体的以上特性使其在诊断检测领域展现出广阔的应用前景。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年约有100多万妇女患有乳腺癌，平均每13分钟就有一位女性死于乳腺癌。平均每两分半钟即有一位女性被诊断为乳腺癌患者。我国女性乳腺癌发病率以每年3%-4%的速度递增，其死亡率排在女性癌症死亡率之首，患者明显趋向年轻化。调查显示，每8位女性中就有1位遭受乳腺癌的威胁。面对这一严峻形势，我国已将筛查乳腺癌疾病纳入全民公共卫生服务项目，以此来降低患病率及死亡率。在乳腺癌中PI3K-AKT通路的活化率高达70%，并且其在原发性和转移性乳腺癌中发生都比较频繁。目前常规检测是对患者的活检组织进行定性、半定量方法免疫组化（IHC），但此法耗时较长且操作繁琐。因此为了及时对乳腺癌PI3K表达的特异性检测过表达患者进行个体化、靶向性有效的治疗，制备乳腺癌PI3K的纳米抗体来进行疾病检测及治疗具有广阔的前景。目前，也没有针对乳腺癌PI3K为靶标的特异性纳米抗体及临床检测试剂的研究报道。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供一种针对PI3K的纳米抗体，同时提供该纳米抗体的编码序列及该纳米抗体在制备检测的应用。技术方案：本专利技术的技术方案为：本专利技术的第一方面，提供了一种针对PI3K重链抗体VHH，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4。所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。优选地，所述的PI3K纳米抗体的VHH链，它具有SEQIDNO：8所示的氨基酸序列。本专利技术第二方面，一种针对PI3K重链抗体VHH，此抗体特异性识别PI3K抗原，包括一条具有SEQIDNO：8所示氨基酸序列的VHH链。本专利技术第三方面，提供了一种DNA分子，它编码选自下组的蛋白质：本专利技术所述的PI3K重链抗体VHH。优选地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有选自下组的DNA序列：SEQIDNO：9。有益效果：与现有技术相比，本专利技术的优点如下：本专利技术将血液中提取的PI3K免疫新疆单峰驼，随后利用该骆驼外周血淋巴细胞建立了针对于PI3K的纳米抗体基因库，试验中将PI3K偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），从而获得了针对PI3K特异性的纳米抗体基因，将此基因转至大肠杆菌中，从而建立了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。附图说明图1是PI3K纳米抗体的基因电泳图；其中泳道1是DNA分子标准，泳道2是PCR扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，PCR产物条带约为700bp。图2是PI3K纳米抗体的DNA琼脂糖凝胶电泳图，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为1000bp的分子标记，其余孔道为PCR扩增重链抗体可变区片段产物，PCR产物条带约为500bp；图3是是构建的单域抗体文库的插入率检测结果，从左到右凝胶孔的DNA条带分别是：第一道为DNA分子标记，其余孔道为检测插入片段的PCR产物，经检测，该文库的插入率达到90％以上。图4是用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA）筛选特异性单个阳性克隆的模式图；其中1是将PI3K蛋白偶联在酶标板上，2是纳米抗体，3是鼠抗HA抗体，4是山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记的抗体，5是碱性磷酸酶显色液。图5是表达的PI3K纳米抗体，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳图；其中泳道1是蛋白分子标准，其余泳道是250毫摩尔咪唑洗脱液所洗脱下来的纳米抗体，结果显示PI3K纳米抗体经过该纯化过程，其纯度可达到95%以上。图6是PI3K纳米抗体在不同环境温度下的耐受性检测。具体实施方式本专利技术首先将PI3K的可溶性蛋白作为抗原免疫一只新疆单峰驼，经过5次免疫之后提取该单峰驼外周血淋巴细胞并构建了PI3K特异的单域重链抗体文库。将PI3K偶联在NUNC酶标板上，展示蛋白质的正确空间结构，使得PI3K的抗原表位得以暴露出来，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选PI3K免疫性的纳米抗体基因库（骆驼重链抗体噬菌体展示基因库），而获得了能在大肠杆菌中高效表达的纳米抗体株。下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。实施例1针对于PI3K的纳米抗体文库的构建：（1）首先合成抗原PI3K，用于免疫所用的PI3K的浓度为500μg/mL，每次免疫将0.5mgPI3K与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰驼(句容圣龙家畜养殖厂)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐剂（购自sigma），剩余几次全部使用弗式不全佐剂（购自sigma），免疫过程中刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体。（2）5次免疫结束后，提取骆驼外周血淋巴细胞100mL并提取总RNA参照QIAGEN公司提供的RNA提取试剂盒。（3）按照Super-ScriptIIIFIRSTSTRANDSUPERMIX试剂盒说明书，将提取的RNA反转录成cDNA。用巢式PCR扩增重链抗体的可变区片段：第一轮PCR：上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC下游:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC扩增重链抗体引导肽和抗体CH2之间的片段，54℃退火，25个循环；结果如图1显示该片段的大小约为700bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA的分子Marker，第二单域抗体基因电泳带约为700bp。第二轮PCR：以第一轮PCR产物作模板，上游引物：GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG下游引物：GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT扩增重链抗体FR1区和长、短铰链区之间的片段（长片段和短片段），60℃退火，17个循环，回收目的片段，结果如图2显示，该片段的大小约为500bp，即从左到右的DNA条带分别是：第一为DNA分子Marker，第二纳米抗体基因电泳带约为500bp。（4）使用限制性的内切酶（购自NEB）PstI及NotI酶切20μgpComb3噬菌体展示载体（Biovector供应）及10μgVHH并用T4DNA连接酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
PI3K纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQ ID NO：1所示的FR1，SEQ ID NO：2所示的FR2，SEQ ID NO：3所示的FR3，SEQ ID NO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQ ID NO：5所示的CDR1，SEQ ID NO：6所示的CDR2，SEQ ID NO：7所示的CDR3。

【技术特征摘要】
1.PI3K纳米抗体的VHH链，包括框架区FR和互补决定区CDR，所述框架区FR选自下组的FR的氨基酸序列：SEQIDNO：1所示的FR1，SEQIDNO：2所示的FR2，SEQIDNO：3所示的FR3，SEQIDNO：4所示的FR4；所述互补决定区CDR选自下组的CDR的氨基酸序列：SEQIDNO：5所示的CDR1，SEQIDNO：6所示的CDR2，SEQIDNO：7所示的CDR3。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：劳英斌，
申请(专利权)人：南京东极生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32