本发明专利技术公开了稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用。本发明专利技术将去信号肽的鸡白介素10编码基因定向克隆于含有新霉素抗性基因的真核表达载体中，获得重组质粒并将其转染中国仓鼠卵巢细胞系CHO-K1细胞，经G418加压筛选、纯化、获得稳定、高效表达chIL-10蛋白的细胞系CHO-chIL-10M，其微生物保藏号是CGMCC?NO.7659。本发明专利技术所构建的细胞系CHO-chIL-10M在制备重组鸡白介素10蛋白以及鸡白介素10单克隆抗体等方面有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系及其构建方法和应用
本专利技术涉及一株表达重组鸡白介素的细胞系，尤其涉及一株稳定表达鸡白介素10融合蛋白的细胞系，本专利技术进一步涉及该细胞系的构建方法及其应用，属于重组鸡白介素10蛋白的制备领域。
技术介绍
白细胞介素简称白介素，是由白细胞产生的、介导细胞间相互作用的细胞因子，在细胞的活化、增殖和分化中起调节作用。随着分子生物学的发展，有关鸡白介素基因和功能的研究已逐渐成为热点，迄今为止，已从鸡中分离出多种白介素，例如:IL-l、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18等，这些白介素能够应用于免疫治疗剂、免疫增强剂、构建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等细胞因子增强或调节机体的非特异性免疫，不仅会有效防控畜禽疾病，还能在畜牧业生产中产生巨大的经济效益。现有的制备重组鸡白介素10蛋白的基因工程方法不同程度的存在着表达效率较低、表达不稳定等缺陷，有待改进。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系；本专利技术的目的之二是提供构建所述稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系的方法；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的:本专利技术分别扩增鸡chIL-10全部编码基因(euchIL-10F)和鸡去信号肽编码基因(euchIL-ΙΟΜ),分别定向克隆于含有报告基因eGFP和新霉素抗性基因(neo)的真核表达载体pEGFP-Nl中，经酶切及测序鉴定，获得重组质粒Nl-euchIL-10F和Nl-euchIL_10M。本专利技术将获得的重组质粒Nl-euchIL-10F和Nl-euchlL-lOM分别转染中国仓鼠卵巢细胞系CH0-K1细胞，经G418加压筛选、纯化，获得表达chIL-10蛋白的细胞系CH0-chIL-10M和CH0-chIL-1OFο CHO-chlL-lOM和CH0-chIL-10F细胞系经过连续2次单克隆纯化，传代培养至第26代，在FITC滤光通道下，CHO-chlL-lOM仍能够观察到报告基因eGFP蛋白激发的强绿色荧光，而CHO-chlL-lOF荧光较弱；实验结果表明2种重组真核表达质粒都能在CH0-K1细胞中表达重组鸡白介素10蛋白，但是细胞系CHO-chlL-lOM表达重组鸡白介素10蛋白的表达效率要远远高于CHO-chlL-lOF表达重组鸡白介素10蛋白的表达效率，且细胞系CHO-chlL-lOM表达重组鸡白介素10蛋白的稳定性要远远优于CH0-chIL-10F的稳定性。RT-PCR鉴定结果表明，chIL-10全部编码基因(euchIL-10F)和鸡去信号肽编码基因(euchIL-ΙΟΜ)分别在CH0-chIL-10F和CH0-chIL-10M细胞系中获得稳定表达，但是CHO-chlL-lOM细胞系中鸡去信号肽编码基因的的表达强度是CHO-chlL-lOF细胞系中chIL-10全部编码基因的4-6倍左右。Western blot检测结果显示，chIL-10全部编码基因(euchlL-lOF)和鸡去信号肽编码基因(euchIL-ΙΟΜ)均在细胞中得到正确表达，但是CH0-chIL-10M细胞系中鸡去信号肽的白介素10编码基因的表达量要远远高于CHO-ChIL-1OF中鸡白介素10全部编码基因的表达量。IFA检测结果表明，鼠抗Ch IL-10血清与细胞系CH0_ch IL-1OF和CH0_ch IL-1OM均呈现特异性红色荧光，而兔抗chIL-10血清不与任何细胞株反应。有无信号肽对IL家族成员体外表达的效果是事先难以预期的。李行(李行，稳定表达鸡IL-18蛋白细胞系的建立及鸡IL-18单克隆抗体的制备，2012，硕士论文)研究发现，在其它条件相同情况下，与不含信号肽相比，鸡IL-18有信号肽会明显促进其体外表达的效率或表达量；本专利技术的实验非常意外的发现，将鸡IL-18的信号肽去掉后，其在细胞中的表达效率或表达量要远远高出鸡白介素10全长基因的表达效率或表达量。鉴于CHO-chlL-lOM细胞系中鸡去信号肽的白介素10编码基因的表达量或表达效率远远高于CHO-chlL-lOF中鸡白介素10全部编码基因的表达量或表达效率，本专利技术将细胞系CHO-chlL-lOM提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为=CGMCCN0.7659 ;分类命名为:中国仓鼠卵巢细胞系。保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2013年5月29日:保藏地址:中国北京朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所；本专利技术所构建的细胞系CHO-chlL-lOM能够高效、稳定的表达重组鸡白介素10蛋白，在制备重组鸡白介素10蛋白以及鸡白介素10单克隆抗体等方面有广泛的应用前景。本专利技术涉及到术语术语“多核苷酸”或“基因”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述 类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA (肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer 等人,Nucleic Acid Res.19:5081 (1991) ; Ohtsuka 等人，J.Bio1.Chem.260:2605-2608(1985);和 Cassol 等人，(1992) ; Rossolini 等人，Mol Cell.Probes8:91-98(1994))。术语“报告基因”是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。术语“宿主细胞”意指包含本专利技术多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。术语“转化”:将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。术语“表达”:内源性基因或转基因在细胞中的转录和/或翻译。术语“编码序列”:转录成RNA的核酸序列。术语“真核表达载体”:一种或多种用于实现真核生物转化的DNA载体，包含真核细胞转录和翻译所需的调控元件，如启动子、多聚A加尾信号等；此外，还可以有选择标记基因、目的基因以及真核细胞能够识别的复制位点。【附图说明】图1G418加压筛选12d抗性集落的形成(F1，100X)。图2转染24h后共聚焦显微镜扫描图。图3chIL_10基因在CHO-Kl细胞中稳定表达(100X)的结果。图4 稳定表达 chlL-lOCHO 细胞株的 RT-PCR 鉴定；1: CHO-chlL-本文档来自技高网...
【技术保护点】
稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系CHO?chIL?10M，其特征在于，其微生物保藏编号为：CGMCC?NO.7659。
【技术特征摘要】
1.稳定表达鸡白介素10蛋白的细胞系CHO-chlL-lOM，其特征在于，其微生物保藏编号为:CGMCC N0.7659。2.—种构建权利要求1所述细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤:将去信号肽的鸡白介素10编码基因定向克隆于含有新霉素抗性基因的真核表达载体中，获得重组质粒；将获得的重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩凌霞，廉传江，文辉强，司昌德，林欢，陈洪岩，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，哈尔滨动物生物制品国家工程研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：
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