一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法技术

本发明专利技术提供一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，包括以下步骤：（1）PUMA-/-(PUMA基因敲除)小鼠或PUMA-/+小鼠成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX-Oct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；（3）逆转录病毒的包装、滴度测定与冻存；（4）PUMA基因敲除小鼠或PUMA-/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程；（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程。本发明专利技术的有益效果是通过在体细胞重编程步骤中抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效，同时能够保护iPS细胞基因组稳定性。

【技术实现步骤摘要】
—种抑制PUMA功能改善i PS细胞建立功效的方法
本专利技术属于干细胞领域，尤其是涉及。
技术介绍
将0CT4、S0X2、 KLF4和c_Myc四个转录因子同时导入小鼠皮肤成纤维细胞，可重编程形成类似于胚胎干细胞的一类新型细胞，被称为iPS细胞。2007年，iPSCs技术在人的体细胞上取得成功，iPS细胞具有胚胎干细胞的多向分化能力，是各类疾病发病机制研究和药物筛选的最佳材料；也是一些退行性疾病将来治疗的新希望。但大量研究表明，iPS细胞在重编程中诱发了相当数量的DNA损伤以及染色体结构的改变，进而导致iPS细胞具有潜在的致癌性，并且效率很低。所以在将iPS细胞应用于临床治疗之前，安全性和有效性成为该技术应用的关键。p53，一种重要的肿瘤抑制蛋白，可通过触发细胞凋亡、调控细胞周期及加速细胞衰老方式抑制肿瘤发生。在大多数肿瘤中P53处于失活状态。研究证实沉默p53可显著地增加iPS细胞的诱导效率，不仅对病毒载体诱导技术有用，对用质粒或蛋白诱导转化技术同样有用。Marion等表示缺乏p53的iPS细胞基因组不稳定，而且不能有效地发育成嵌合体小鼠[1]，Utikal等证实暂时性而不是永久性抑制p53可促进重编程的效率[2]。但沉默P53同样会增加基因组不稳定性和肿瘤的发生性，其分子机制与其下游的p21有关。这正好验证了 iPS产生具有细胞周期依赖和非细胞周期依赖两种模式。但目前的研究均忽略了在重编程过程中细胞凋亡因素。而P53也是通过调节PUMA的表达来调控细胞凋亡。2001年，Yu [3]和Nakano等[4]两个独立的研究小组分别从结直肠癌细胞系和人类成骨细胞样细胞中分离出新的可被P53快速诱导并具有强大促凋亡作用的p53靶基因，后被鉴定为同一基因，并命名为PUMA。PUMA直接或间接地与抗凋亡Bcl-2蛋白发生相互作用，解除Bcl-2/Bcl-xL对Bax/Bak的抑制作用，Bax/Bak构象改变后在线粒体膜上形成寡聚物，使膜通透性增加、外膜电势降低、释放细胞色素C入胞质，启动caspase级联反应，最终发生细胞凋亡。生理状况下PUMA表达量较低，但在DNA损伤药物、血清饥饿和内质网应激等刺激诱导下可显著升高。本实验室和其他实验室研究表明失去PUMA可以在高剂量照射条件下，通过减少凋亡保护造血干细胞和小肠干细胞等成体干细胞[5-9]。并且在很多疾病模型中未发现失去PUMA可以促进肿瘤的发生[5-8，10-11]。我们初步实验结果表明敲除PUMA和p53 —样具有促进iPS产生的作用，但根据以往报道中PUMA和p53对肿瘤发生的作用相反，其对iPS细胞重编程中基因组稳定性和致癌性的作用机制很是令人期待。PUMA作为P53下游凋亡通路的重要分子，抑制或敲除PUMA在成体干细胞中具有明显的抗放射和抑制肿瘤形成的作用，但其对iPS的产生和基因组稳定性的作用以及分子机制还不是很清λ.Μ/E.ο参考文献1.Marion RMj Strati K, Li H, Murga M，Blanco R，et al.(2009) A p53_mediatedDNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity.Nature460:1149-1153.2.Utikal Jj Polo JM，Stadtfeld Mj Maherali Nj Kulalert Wj et al.(2009)Immortalization eliminates a roadblock during cellular reprogramming into iPScells.Nature460:1145-1148.3.Yu J，Zhang Lj Hwang PM, Kinzler KWj Vogelstein B (2001) PUMA induces therapid apoptosis of colorectal cancer cells.Mol Cell7:673-682.4.Nakano Kj Vousden KH(2001)PUMA, a novel proapoptotic gene, is induced byp53.Mol Cell7:683-694.5.Labi Vj Erlacher Mj Krumschnabel Gj Manzl Cj Tzankov A，et al.(2010)Apoptosis of leukocytes triggered by acute DNA damage promotes lymphomaformation.Genes Dev24:1602-1607.6.Michalak EMj Vandenberg CJj Delbridge AR, Wu L，Scott CL, et al.(2010)Apoptosis-promoted tumori genes i s:gamma-1rradiat ion-1nduced thymiclymphomagenesis requires Puma-driven leukocyte death.Genes Dev24:1608-1613.7.Yu H，Shen H，Yuan Y，XuFeng R，Hu X，et al.(2010)Deletion of Pumaprotects hematopoietic stem cells and confers long-term survival in response tohigh-dose gamma-1rradiation.Bloodl15:3472-3480.8.Shao L，Sun Y，Zhang Z，Feng Wj Gao Y，et al.(2010) Deletion ofproapoptotic Puma selectively protects hematopoietic stem and progenitor cellsagainst high-dose radiation.Blood 115:4707-4714.9.Qiu Wj Carson-Walter EBj Liu Hj Epperly Mj Greenberger JSj et al.(2008)PUMA regulates intestinal progenitor cell radiosensitivity and gastrointestinalsyndrome.Cell Stem Cell2:576-583.10.Jeffers JRj Parganas E，Lee Y，Yang Cj Wang J，et al.(2003) Puma is anessential mediator of p53_dependent and-1ndependent apoptotic pathways.CancerCell4:321-328.11.Villunger A，Michalak EM，Coultas Lj Mullauer F，Bock G，et al.(2003)p53_and drug-1nduced apopto本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）PUMA?/?(PUMA基因敲除)或PUMA?/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存；（2）DH5α大肠杆菌株转化质粒PMX?Oct4、PMX?Sox2、PMX?c?Myc和PMX?KLF4，并进行质粒小提和质粒大提；（3）逆转录病毒载体的包装、滴度测定与冻存：将携带有PMX?Oct4、PMX?Sox2、PMX?c?Myc和PMX?KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat?E细胞中，回收在培养上清液中产生的逆转录病毒载体，并进行滴度测定与冻存；（4）PUMA?/?或PUMA?/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程将步骤（3）中的携带有PMX?Oct4、PMX?Sox2、PMX?c?Myc和PMX?KLF44个转录因子的逆转录病毒载体感染步骤（1）得到的PUMA?/?或PUMA?/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并用饲养层细胞支持培养感染的PUMA?/?或PUMA?/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，连续培养，出现的克隆为PUMA?/?或PUMA?/+小鼠iPS细胞；（5）敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程将人PUMA?shRNA（载体Plk0.1）和携带有人PMX?Oct4、PMX?Sox2、PMX?c?Myc和PMX?KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat?E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，并用饲养层细胞支持培养感染的人成纤维细胞，培养7天后，用条件培养基培养，连续培养，出现的克隆为敲降PUMA功能的人iPS细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)PUMA+(PUMA基因敲除)或PUMA_/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的制备、传代、冻存； (2)DH5 α 大肠杆菌株转化质粒 PMX-0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和 PMX-KLF4，并进行质粒小提和质粒大提； (3 )逆转录病毒载体的包装、滴度测定与冻存:将携带有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E细胞中，回收在培养上清液中产生的逆转录病毒载体，并进行滴度测定与冻存； (4)PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF的重编程 将步骤(3)中的携带有PMX-0ct4、PMX-Sox2、PMX-c-Myc和PMX-KLF44个转录因子的逆转录病毒载体感染步骤(1)得到的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，并用饲养层细胞支持培养感染的PUMA+或PUMA_/+小鼠胚胎成纤维细胞MEF，连续培养，出现的克隆为PUMA+ 或 PUMA_/+ 小鼠 iPS 细胞； (5)敲降PUMA功能的人成纤维细胞的重编程 将人 PUMA shRNA (载体 Plk0.1)和携带有人 PMX_0ct4、PMX_Sox2、PMX-c-Myc 和PMX-KLF44个转录因子的质粒引入包装细胞Plat-E中，回收在培养上清液中产生的病毒载体，并将回收的病毒载体感染人成纤维细胞，并用饲养层细胞支持培养感染的人成纤维细胞，培养7天后，用条件培养基培养，连续培养，出现的克隆为敲降PUMA功能的人iPS细胞。2.根据权利要求1所述的 抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于:所述步骤(1)中的具体步骤为:取8-10周的PUMA+或PUMA_/+小鼠，按2:1的雌雄比例合笼，处死孕期为13.5天的孕鼠，将小鼠胚胎从子宫中剥离，去除头和内脏组织，将单个胚胎的躯干，剪碎至糊状，胰酶消化，FM重悬，培养24-48h后，将MEF细胞按常规方法进行传代，2 XFM冻存液冻存PO代、Pl或P2代细胞。3.根据权利要求1-2任一项所述的抑制PUMA功能改善iPS细胞建立功效的方法，其特征在于:所述步骤(3)的具体步骤为:每IOOmm皿接种8xl06_lxl07个Plat-E细胞，融合度达到90%时，将培养皿中的细胞培养液换成5ml新鲜DMEM+10%FBS，制备质粒和lipofectamine2...

【专利技术属性】
技术研发人员：程涛，李彦欣，
申请(专利权)人：中国医学科学院血液病医院血液学研究所，
类型：发明
国别省市：