一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法技术

本发明专利技术涉及一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，该方法包括如下步骤：1)大理裂腹鱼肾脏组织的获取：采用高锰酸钾和酒精联合对大理裂腹鱼进行消毒；2)原代培养：采用含有细胞生长因子、青霉素、链霉素、两性霉素B，渗透压为的280‑300mOsm/L的L‑15或DMEM/F12培养液进行培养；3)传代培养：传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述大理裂腹鱼肾脏细胞系建立成功。本发明专利技术的构建方法所获得的大理裂腹鱼肾脏细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，不仅能满足对大理裂腹鱼这一珍稀物种种质资源保存和理论研究的需要，同时也是大理裂腹鱼的首个细胞系，为大理裂腹鱼细胞水平的高原适应性研究奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种利用大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存的

技术介绍
大理裂腹鱼(Schizothoraxtaliensis)隶属于鲤科裂腹鱼亚科裂腹鱼属，原是洱海特产的经济鱼类，历史上占洱海渔获物30％。上世纪70年代由于洱海水位下降，数十条河沟、鱼洞干涸，大理裂腹鱼失去产卵场，且外来种的引入，大量吞食大理裂腹鱼的鱼卵，加之，酷鱼滥捕使大理裂腹鱼数量锐减。从中国科学院昆明动物研究所鱼类标本库采集记录看，自从1973年最后一次被采集后，已经43年没有发现大理裂腹鱼，在学术界上一致认为大理裂腹鱼从大理洱海流域灭绝。大理裂腹鱼1989年被列为国家II级保护动物，在《中国濒危动物红皮书(鱼类)》中被列为濒危等级，为保护这一珍稀物种地方政府制定了《洱海管理条例》。大理裂腹鱼生活在静水环境的中上层，食物以浮游生物为主，产卵时要求流水环境，每年4-5月繁殖季节，亲鱼溯水上游到沙砾底河床的河流或湖底地下水出口处产卵。卵需在流水中孵化。为保护和了解大理裂腹鱼的生存状况，自上世纪九十年代以来，中国科学院昆明动物研究所多次组队至大理洱海、西洱河、弥苴河等地本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，其特征在于构建方法包括如下步骤：1)大理裂腹鱼肾脏的获取：先用10‑20mg/L的高锰酸钾浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体10‑20分钟，再用80‑100ppm的MS‑222麻醉大理裂腹鱼鱼体；再以75％酒精擦拭鱼体后，取其肾脏，加入PBS消毒液清洗大理裂腹鱼鱼体的肾脏组织；2)原代培养：将步骤1)获得的肾脏组织剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在18‑20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18‑20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第10‑12天细胞开始从组织块中迁移，30‑40天长成细胞单层，则原代肾脏细胞；3)传代培养：原代...

【技术特征摘要】
1.一种大理裂腹鱼肾脏细胞系的构建方法，其特征在于构建方法包括如下步骤：1)大理裂腹鱼肾脏的获取：先用10-20mg/L的高锰酸钾浸泡消毒大理裂腹鱼鱼体10-20分钟，再用80-100ppm的MS-222麻醉大理裂腹鱼鱼体；再以75％酒精擦拭鱼体后，取其肾脏，加入PBS消毒液清洗大理裂腹鱼鱼体的肾脏组织；2)原代培养：将步骤1)获得的肾脏组织剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，在18-20℃培养箱中倒置过夜，次日再加入原代培养液，在18-20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第10-12天细胞开始从组织块中迁移，30-40天长成细胞单层，则原代肾脏细胞；3)传代培养：原代肾脏细胞铺满瓶底80％后开始传代，先吸出培养瓶中的原代培养液，以含0.1-0.2％的胰蛋白酶-EDTA的胰酶消化法传代悬起细胞，加入传代培养液1-2mL以中和胰酶反应，首次传代按1:1传，此后按1:2进行传代，于18-20℃培养箱中继续培养；每5-7天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，所述大理裂腹鱼肾脏细胞系建立成功。2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述PBS消毒液为含有浓度为100-300IU/mL的青霉素、浓度为100-300μg/mL的链霉素以及浓度为20-40μg/mL的两性霉素B的混合溶液。3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述基础培养液为含有浓度为6-10ng/mL的bFGF和占总体积的10-15％的胎牛血清的L-15或DMEM/F12培养液的混合溶液。4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的原代培养液为含有浓度为6-10ng/mL的bFGF、占总体积的15-20％的胎牛血清、浓度为200-300IU/mL的青霉素、浓度为20...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓爱，潘晓赋，杨君兴，范伟，刘倩，
申请(专利权)人：中国科学院昆明动物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53