本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法。其中，用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法为：构建报告质粒；利用报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。本发明专利技术提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系及其测定方法，用于杆状病毒滴度测定时更为快速，测定结果更为准确。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种。
技术介绍
杆状病毒是一类DNA病毒，广泛存在于自然界，主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目昆虫，其感染能够导致昆虫的液化死亡。随着研究的深入，杆状病毒已在生物杀虫剂、真核表达、表面展示以及基因治疗等方面得到越来越广泛的应用。为使杆状病毒能在应用中发挥最大的功效，就必须对杆状病毒进行定量，即进行病毒滴度的测定。病毒滴度即病毒的毒力或毒价。在相关技术中，杆状病毒滴度普遍采用终点稀释法(endpoint dilution)进行测定,指能使半数细胞出现病变的病毒稀释度。该方法需通过观察细胞病变来确定病毒的滴度。在测定过程中，可以有一些方法是采用Sf9昆虫细胞为被感染细胞的。但是，由于Sf9昆虫细胞是一种圆形的细胞，当被杆状病毒感染后，其病变主要表现为细胞核膨大；而Sf9昆虫细胞在细胞老化时也容易出现细胞核膨大的现象，因此，通过观察很难判断细胞核膨大的现象是否是由杆状病毒所致，进而造成病毒滴度测定的结果不准确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，以解决上述的问题。本专利技术的实施例提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为:CCTCC N0.C2013133 ;其保藏命名为:携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9-p，其保藏日期为2013年9月4日。在本专利技术的实施例中还提供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其构建方法包括以下步骤:构建报告质粒；所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。本专利技术实施例提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其整合了能够编码绿色荧光蛋白的报告基因以及诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因。重组细胞系在受到相应启动子来源的病毒(杆状病毒)的感染后，杆状病毒早期基因的表达产物将激活位于报告基因上游的杆状病毒的晚期基因的启动子，从而启动了报告基因的表达得到绿色荧光蛋白。在进行杆状病毒滴度测定时，该重组细胞系通过观察被感染细胞的荧光产生而非细胞病变(如，Sf9昆虫细胞的细胞核膨大)则可确定杆状病毒的滴度。而感染后的发出荧光的细胞可通过常规的通过流式细胞仪等仪器进行定量，进而使得测定结果更为准确。本专利技术的实施例还提供了一种利用该重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法，包括以下步骤:将重组细胞系制成细胞悬液；在待测的杆状病毒液中加入所述细胞悬液，恒温培养预定时间后通过观察荧光情况进行病毒滴度计算，得到滴度。【附图说明】图1示出了本专利技术实施例二提供的重组细胞系的构建方法流程图；图2示出了本专利技术实施例二提供的重组细胞系测定杆状病毒的滴度的方法流程图；图3示出了本专利技术实施例一和实施例提供的报告质粒的结构示意图。【具体实施方式】下面通过具体的实施例子并结合附图对本专利技术做进一步的详细描述。实施例一在本专利技术的实施例中提 供了一种用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，包括以下步骤:构建报告质粒；其中，所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。本专利技术实施例提供的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其整合了能够编码绿色荧光蛋白的报告基因以及诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因，重组细胞系在受到相应启动子来源的病毒(杆状病毒)的感染下，杆状病毒早期基因的表达产物将激活位于报告基因上游的杆状病毒的晚期基因启动子，从而启动了报告基因的表达得到绿色荧光蛋白。在进行杆状病毒滴度测定时，该重组细胞系通过观察被感染细胞的荧光产生而非细胞病变(如，Sf9昆虫细胞的细胞核膨大)则可确定杆状病毒的滴度。而感染后的发出荧光的细胞可通过常规的通过流式细胞仪等仪器进行定量，进而使得测定结果更为准确。此外，在本专利技术的上述实施例中，由于该重组细胞系的报告基因是受到杆状病毒晚期基因的启动子的调控，其所调控的基因一般在被杆状病毒感染18-24小时后就开始表达，到3-5天时表达的绿色荧光蛋白的量已经非常大；因此，在荧光显微镜下能很清楚的观察到；相比之下，传统的细胞病变观察却需要被感染7-9天才可能通过肉眼在显微镜下得以辨别，因此该细胞系用于杆状病毒滴度测定时更为快速。由于该细胞系的报告基因的表达需要受到相应启动子来源的杆状病毒基因的诱导，即重组细胞系只有被杆状病毒感染后才会表达，并且使得细胞显现出荧光，相比于通过观察细胞病变的操作，可避免因细胞老化出现类似的病变形态从而导致判断结果不准确的缺陷。为了使得本专利技术实施例一的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系得到更好的应用，更加有效应用到各领域中，本专利技术还在上述实施例一的基础之上提供了实施例二，实施例二是对实施例一的构架方法做出的进一步的增加和限定，现做详细的阐述和解释:实施例二请参考图1，本实施例的构建方法包括以下步骤:步骤101:构建报告质粒；由于杆状病毒基因表达是一个时序性的过程，按照表达时间的先后，可以将杆状病毒基因分为早期基因和晚期基因。考虑到启动子对报告基因表达的时序性及表达量的要求，在设计报告质粒的过程中优选利用包含多角体蛋白基因启动子P基因的杆状病毒极晚期基因来调控报告基因的表达。具体的，报告质粒的构建可以通过以下方法得到:1.以瞬时表达载体质粒 pIZ/V5_His (Invitrogen, Life Science)为出发,用限制性内切酶Bsm I和Spe I酶切回收大小为2248bp的条带，获得载体框架pIZ/V5。2.以Pph-f/r为引物(序列如下)，pFastBacDual为模板(含有多角体蛋白基因启动子Pph序列)，进行PCR扩增获得Pph序列；该步骤2中PCR的反应过程为:94°C 预变性 5min ；94O变性 15s ;58O退火 30s;68°C延伸 25s。上述过程为一个循环，总共进行37个循环，最后68°C延伸lOmin，回收PCR产物Pph (P基因)后利用Bsm I和Spe I进行酶切并回收。Pph-f:5， -CGCTGCATTCCTCCGGAATATTAATAGATCATGPph-r:5，-GGACTAGTGGATCCGCGCCCGATGGTG3.利用T4DNA连接酶连接载体pIZ/V5和片段Pph(P基因)，将连接产物转化感受态细胞DH5 α，涂平板，挑取单克隆培养后提质粒进行鉴定。将阳性克隆即插入了片段Pph (P基因)的克隆命名为plZPph。4.以EGFP primer-f/r为引物(序列见下)，pEGFP_N3为模板，进行PCR扩增获得EGFP片段。该步骤4中PCR反应过程为:94°C 预变性 5min ；94°C变性 15s ;58 °C 退火 30s;68O延伸 30s。上本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其特征在于，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：CCTCC?No.C2013133；其保藏命名为：携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9?p。
【技术特征摘要】
1.用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系，其特征在于，该重组细胞系保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为=CCTCC N0.C2013133 ;其保藏命名为:携带P基因的斜纹夜蛾卵巢细胞系Sf9-p。2.权利要求1所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:构建报告质粒；所述报告质粒包括其中插入了编码绿色荧光蛋白的报告基因、诱导所述报告基因表达的所述杆状病毒的晚期基因的启动子P基因；利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞；将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆；将所述单细胞克隆继续用含有博来霉素的培养基筛选，得到重组细胞系。3.根据权利要求2所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，在所述利用所述报告质粒转染Sf9昆虫细胞的步骤中，所述转染的时间为46-50小时。4.根据权利要求2所述的用于杆状病毒滴度测定的重组细胞系的构建方法，其特征在于，在所述将转染后的所述Sf9昆虫细胞用含有博来霉素以及胎牛血清的培养基筛选，得到单细胞克隆的步骤中，所述培养基为:含有200ng/ml-800ng/ml的博来霉素以及体积分数为10%的胎牛血清的Grace培养基。5.根据权利要求1所述的用于杆状病毒滴度...
【专利技术属性】
技术研发人员：邓菲，邓马平，张艳芳，王华林，胡志红，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：
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