一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用。通过实验证明：黄热病毒的RPA引物和探针可有效扩增靶基因，特异性达100％，灵敏度为1×102copies/反应，且在临床模拟样本中可检测到的病毒滴度为102TCID50/mL，与荧光定量PCR的灵敏性也相当；与同属登革病毒、乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒核酸均无交叉反应。本发明专利技术的RPA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在37‑42℃条件下，均可实现靶基因的有效扩增，不仅可用于黄热病毒感染核酸的现场快速检测，也为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。同时对于防止黄热病毒在中国的感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于RPA技术的黄热病毒检测试剂盒及其应用。
技术介绍
黄热病毒(Yellowfevervirus)属于黄病毒科黄病毒属，可引起严重的出血热症状，传染性强，病死率为23％～90％。以急性发热伴有严重出血为主要表现特征。黄热病主要流行于非洲，中国并非黄热病毒的流行区域，但随着全球贸易、旅游业的飞速发展，不同国家、不同地区的人类交流日益频繁，很多传染病已打破了地区、国界的限制，传播范围日益广泛，我国也多次面临输入性传染病的威胁。2016年3月，我国曾出现一例输入性黄热病毒感染。我国人口多，人口密度大，黄热病毒一旦在我国传播，后果不堪设想。为了应对今后可能出现的黄热病毒感染，极有必要研制黄热病毒快速检测试剂。人类目前针对黄热病毒的检测主要依靠实时荧光定量PCR技术，需要昂贵的温控设备、特定的实验室场地和专业技术人员操作，且检测时间长，不适用于突发传染病的现场快速检测，因此，建立一种快速简便的核酸检测技术，对黄热病毒的及时发现和鉴别具有重要的意义和价值。重组酶聚合酶等温核酸扩增技术(Recombinasepolymeraseamplification，RPA)是由Piepenburg等人建立的一种新型核酸等温扩增技术，该技术主要依赖于三种酶：结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶UvsX、单链DNA结合蛋白(SSB)和DNA聚合酶，模拟体内DNA复制的酶反应过程对DNA模板进行扩增。在恒温37℃-42℃之间，核酸模板无需变性，20分钟之内即可完成整个扩增过程。同时，RPA技术操作简单，设备要求低，具有灵敏度高、特异性强等特点。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种检测或辅助检测黄热病毒的成套引物。本专利技术提供的检测或辅助检测黄热病毒的成套引物由引物1、引物2和探针组成；所述引物1为如下a1)或a2)：a1)序列1所示的单链DNA分子；a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述引物2为如下b1)或b2)：b1)序列2所示的单链DNA分子；b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：c1)序列3所示的单链DNA分子；c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：d1)序列4所示的单链DNA分子；d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。上述成套引物中，所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔量比为7:7:2。上述成套引物中，所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基T为荧光基团修饰的碱基T；所述荧光基团可为FAM、6-FAM、FITC、HEX、JOE、Phosphate、RhodamineGreen、RhodamineRed、RhodamineB、ROX、TAMRA、NBD、TET或DyLight770，所述荧光基团具体为FAM；所述DNA片段乙自5’端起第一位碱基T为淬灭基团修饰的碱基T；所述淬灭基团可为DABCYL、TAMRA、Eclipse、BHQ1、BHQ2或BHQ3；所述淬灭基团具体为BHQ1。上述成套引物中，所述探针中的DNA片段乙的3’端用C3封闭以阻断延伸，阻止3’端外切酶和聚合酶发挥作用。本专利技术的第二个目的是提供一种检测或辅助检测黄热病毒的RPA试剂。本专利技术提供的检测或辅助检测黄热病毒的RPA试剂包括上述成套引物。上述RPA试剂中，所述引物1和所述引物2在所述RPA试剂中的终浓度均为0.42μM；所述探针在所述RPA试剂中的终浓度为0.12μM。本专利技术的第三个目的是提供一种检测或辅助检测黄热病毒的试剂盒。本专利技术提供的检测或辅助检测黄热病毒的试剂盒包括上述成套引物或上述RPA试剂。本专利技术的第四个目的是提供上述成套引物或上述RPA试剂或上述试剂盒的新用途。本专利技术提供了上述成套引物或上述RPA试剂或上述试剂盒在如下1)-6)中任一种中的应用：1)检测或辅助检测黄热病毒；2)制备检测或辅助检测黄热病毒的产品；3)检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒；4)制备检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒的产品；5)检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒；6)制备检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒的产品。本专利技术的第五个目的是提供一种检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品是否感染黄热病毒的方法包括如下步骤：用上述成套引物对待测样品进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；若RPA扩增产物满足如下条件：在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测样品感染或候选感染黄热病毒；若RPA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测样品未感染或候选未感染黄热病毒。本专利技术的第六个目的是提供一种检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒的方法。本专利技术提供的检测或辅助检测待测病毒是否为黄热病毒的方法包括如下步骤：用上述成套引物对待测病毒进行RPA扩增，得到RPA扩增产物；若RPA扩增产物满足如下条件：在RPA扩增的10min内扩增曲线的荧光信号值超过阈值且出现拐点，则表明扩增结果为阳性，即待测病毒为或候选为黄热病毒；若RPA扩增产物不满足上述条件：则表明扩增结果显示为阴性，即待测病毒不为或候选不为黄热病毒。上述方法中，所述阈值为以RPA扩增起始2min内的荧光信号强度的平均值加上3倍的标准差。上述方法中，所述RPA扩增的模板为待测样品或待测病毒的基因组RNA或DNA；所述RPA扩增的模板具体为待测样品或待测病毒的RNA。本专利技术通过基因组序列分析，选取黄热病毒的特异核酸片段作为检测的靶基因，并针对靶基因序列设计了RPA检测引物和探针，制备了黄热病毒的RPA检测试剂盒，建立了检测黄热病毒的一步法RPA技术。通过实验证明：黄热病毒的RPA引物和探针可有效扩增靶基因，特异性达100％，灵敏度为1×102copies/反应，且在临床模拟样本中可检测到的病毒滴度为102TCID50/mL，与荧光定量PCR的灵敏性也相当；与同属登革病毒、乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒核酸均无交叉反应。本专利技术的RPA等温扩增体系，反应快速，温度范围宽，在37-42℃条件下，均可实现靶基因的有效扩增，不仅可用于黄热病毒感染核酸的现场快速检测，也为病原体的现场筛查提供了可用的快速检测方法。同时对于防止黄热病毒在中国的感染传播及在疫区、出入境口岸的检验检疫也具有重要意义。附图说明图1为黄热病毒RPA扩增系统的特异性检测。图2为黄热假病毒核酸的RPA检测结果。其中，1-5分别代表不同浓度RNA模板的扩增效果，1-5反应管中的模板量分别为:105copies、104copies、103copies、102copies本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测或辅助检测黄热病毒的成套引物，其由引物1、引物2和探针组成；所述引物1为如下a1)或a2)：a1)序列1所示的单链DNA分子；a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述引物2为如下b1)或b2)：b1)序列2所示的单链DNA分子；b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：c1)序列3所示的单链DNA分子；c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：d1)序列4所示的单链DNA分子；d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种检测或辅助检测黄热病毒的成套引物，其由引物1、引物2和探针组成；所述引物1为如下a1)或a2)：a1)序列1所示的单链DNA分子；a2)将a1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与a1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述引物2为如下b1)或b2)：b1)序列2所示的单链DNA分子；b2)将b1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与b1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述探针依次由DNA片段甲、四氢呋喃和DNA片段乙组成；所述DNA片段甲为如下c1)或c2)：c1)序列3所示的单链DNA分子；c2)将c1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子；所述DNA片段乙为如下d1)或d2)：d1)序列4所示的单链DNA分子；d2)将d1)限定的单链DNA分子进行一个或几个碱基的缺失、插入和/或改变得到的、与c1)限定的单链DNA分子具有相同功能的单链DNA分子。2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔量比为7:7:2。3.根据权利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：所述DNA片段甲自5’端起最后一位碱基T为荧光基团修饰的碱基T；所述DNA片段乙自5’端起第一位碱基T为淬灭基团修饰的碱基T。4.一种检测或辅助检测黄热病毒的RPA试剂，包括权利要求1-3中任一所述的成套引物。5.根据权利要求4所述的RPA试剂，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨银辉，康晓平，吴晓燕，李裕昌，姜涛，曹雪峰，李靖，户义，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11