本申请公开了用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，包括引物对和探针，探针在引物对扩增靶标区域内，引物对上游引物为Seq ID No.1所示序列，下游引物为Seq ID No.2所示序列，探针为Seq ID No.3所示序列或Seq ID No.3所示序列的反向互补序列。本申请的H5N8禽流感病毒检测试剂，对禽流感亚种H5N8具有很强特异性，能够准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性检出H5N8。基于本申请试剂的H5N8禽流感病毒检测方法，耗时短，可很快作出判定结果，对于控制流感流行，减少经济损失，最大限度保护社会人群健康和生命具有很大意义。
【技术实现步骤摘要】
本申请涉及禽流感病毒检测领域，特别是涉及一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。
技术介绍
禽流感是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，也能感染人类，被国际兽疫局定为甲类传染病。人感染后的症状主要表现为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高，通常人感染禽流感死亡率约为33％。此病可通过消化道、呼吸道、皮肤损伤和眼结膜等多种途径传播。流感病毒属正黏病毒科,由8条单股负链RNA构成基因组。流感病毒根据核心蛋白(NP)及基质(M)的抗原性不同，可分为A、B、C三型,其中致病性最强、在世界上流行最广的是A型流感病毒。A型流感病毒根据表面糖蛋白凝血素(HA)的不同,可以分为15个亚型，H1-H15，根据表面糖蛋白神经氨酸酶(NA)的不同可以分为9个亚型N1-N9，因此理论上共有135种亚型组合。H5N8禽流感病毒是禽流感病毒的一种亚型。流感危害极大，变异极强，宿主范围极广，是传播性极强的传染病和人兽共患病，是WHO、FDA、OIE等国际组织联合倡导全球共同防控的重大疫病。流感病毒有抗原漂移和抗原转变的要求，变异性极大，不断涌现新的病毒，近年来新型病毒出现的频率明显加大。1997年香港首次报道H5N1、H9N2感染人，2004年出现H5N1全球性流行，2013年3月在我国首先出现了H7N9型禽流感，2014年12月20日和2015年1月27新增83起人感染甲型H7N9禽流感病毒。H5N2禽流感在东亚多国──主要在越南、韩国、泰国──严重爆发，并造成越南多名病人丧生，中国河北省保定市首次发生H5N2禽流感疫情。2016年前后，广东肇庆和深圳接连出现H5N6流感病例，深圳2例病例中，一人已经死亡。自2014年8月以来，中国境内广东、湖南等12个省份家禽共发生新型H5N6高致病性禽流感25起，我国周边日本、韩国、俄罗斯也均有H5N6发生流行，新出现的H5N6逐步代替H5N1而成为家禽和人群中的优势流行毒株。2014年开始，H5N8开始在欧洲、亚洲和俄罗斯家禽中大规模流行，由于家禽与人的接触关系密切，H5N8必然会传染给人类。基于时效性和准确性上的优势，实时荧光RT-PCR技术已经在疫病检测的很多项目上逐步取代了一般RT-PCR方法，成为疫病检测领域最常用的分子生物学方法。但是到目前为止，我国目前尚没有比较有效的H5N8禽流感病毒的检测试剂和方法的报道。
技术实现思路
本申请的目的是提供一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂、检测方法及应用。本申请采用了以下技术方案：本申请的一方面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，该试剂包括引物对和探针，探针在引物对的扩增靶标区域内，引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’SeqIDNo.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’SeqIDNo.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’SeqIDNo.1所示序列中，Y为C或者T碱基。需要说明的是，SeqIDNo.1所示序列中Y为简并碱基，其可以为C或者T碱基。本申请中，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列，可以理解，在实时荧光检测中，探针是特异性的结合到双链的其中一条链的，只要PCR扩增的时候，将结合的探针破坏，即可产生荧光信号，因此，可以采用SeqIDNo.3所示序列的探针结合到其中一条链上，也可以采用SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列作为探针结合到另一条链上。优选的，探针的5’端标记有HEX荧光基因，3’端标记有BHQ淬灭基团。本申请的另一面公开了本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在H5N8禽流感病毒检测中的应用。本申请的另一面公开了本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在制备H5N8禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。可以理解，本申请的试剂，实际上就针对H5N8禽流感病毒设计的特异性探针和引物，当然可以用于H5N8禽流感病毒的检测，或者用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒或设备。本申请的另一面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂。本申请的另一面公开了一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，该试剂盒中含有至少一组混合试剂，每组混合试剂由12.5μL2×realtimePCRBuffer、1μL25×enzymemix、终浓度0.4μM/L的引物对和终浓度0.2μM/L的探针组成；引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列。需要说明的是，本申请的试剂实际上是针对H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测而设计的，为了方便使用，本申请将反应体系中使用的buffer、酶、引物和探针统一配制成混合试剂，每一组混合试剂就是一个反应体系，直接向其中加入RNA样品就可以进行检测，使用简单方便，不仅避免了配制反应体系的繁琐步骤，而且避免了配制反应体系过程造成的污染。本申请的再一面还公开了一种H5N8禽流感病毒的逆转录实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测样品的基因组RNA；(2)采用权利要求6所述的试剂盒，向所述混合试剂中加入步骤(1)提取的基因组RNA，配制成反应溶液；(3)将步骤(2)配制的反应溶液，在45℃反转录30min、95℃热启动10min，然后进入40个循环：95℃15s、60℃45s，在循环过程中于60℃时采集荧光。优选的，基因组RNA的提取采用RNA提取试剂盒，或者Trizol核酸抽提法。本申请的有益效果在于：本申请的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，对禽流感亚种H5N8具有很强的特异性，能够准确灵敏的从众多禽流感病毒中特异性的检测出H5N8，为新型H5N8禽病毒的检测或监控提供了一种有效的方法和途径。此外，基于本申请的试剂的H5N8禽流感病毒检测方法，其耗时短，可以很快作出结果判定，这对于控制流感的流行，减少经济损失，最大限度的保护全社会人群的健康和生命具有很大的意义。附图说明图1是本申请实施例中H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测的特异性检测结果；图2是本申请实施例中H5N8禽流感病毒逆转录实时荧光PCR检测的灵敏度检测结果。具体实施方式下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。实施例一、反应体系的建立和优化利用人工合成的H5N8禽流感病毒的病毒质粒作为阳性标准品，其它供试样本则利用商品化RNA提取试剂盒或Trizol核酸抽提试剂的提取方法提取病毒基因组RNA，分装后置-20℃保存备用。其它供试样本包括：H5N8灭活毒株、H5N1、H5N2、H9N2、新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、猪流感经典型H1N1毒株、猪流感本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为Seq ID No.1所示序列，所述引物对的下游引物为Seq ID No.2所示序列，所述探针为Seq ID No.3所示序列或者Seq ID No.3所示序列的反向互补序列；Seq ID No.1：5’‑CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA‑3’Seq ID No.2：5’‑TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA‑3’Seq ID No.3：5’‑CCACTGTATCCCGACCAATT‑3’Seq ID No.1所示序列中，Y为C或者T碱基。
【技术特征摘要】
1.一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述试剂包括引物对和探针，所述探针在引物对的扩增靶标区域内，所述引物对的上游引物为SeqIDNo.1所示序列，所述引物对的下游引物为SeqIDNo.2所示序列，所述探针为SeqIDNo.3所示序列或者SeqIDNo.3所示序列的反向互补序列；SeqIDNo.1：5’-CTGCACATAAATACCCAACYCTGTA-3’SeqIDNo.2：5’-TGAGGAATGTTCTTGTTATCCAAATGA-3’SeqIDNo.3：5’-CCACTGTATCCCGACCAATT-3’SeqIDNo.1所示序列中，Y为C或者T碱基。2.根据权利要求1所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂，其特征在于：所述探针的5’端标记有HEX荧光基因，3’端标记有BHQ淬灭基团。3.根据权利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在H5N8禽流感病毒检测中的应用。4.根据权利要求1或2所述的用于H5N8禽流感病毒检测的试剂在制备H5N8禽流感病毒检测试剂盒或设备中的应用。5.一种用于H5N8禽流感病毒检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中含有权利要求1或2所...
【专利技术属性】
技术研发人员：秦智锋，刘建利，唐金明，曾少灵，卢奕良，蔡良语，廖立珊，陈兵，马岚，孙洁，卢体康，陶虹，郑晓聪，林庆燕，陈书琨，詹爱军，兰文升，曹琛福，王津津，
申请(专利权)人：深圳市检验检疫科学研究院，深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，清华大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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