一种测定病毒滴度的方法技术

本发明专利技术提供了一种测定病毒滴度的方法，利用病毒感染细胞的侧向角散射的变化测定病毒的滴度。本发明专利技术的方法，避免了现有技术中测定病毒滴度普遍存在的判断结果主观性过强、测定结果不够准确的问题，可以客观的记录数据，其测定结果具有优越的准确度和精密度。同时还具有操作简单、成本较低的优点，可实现更广泛的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种测定病毒滴度的方法
本专利技术属于检测分析领域，具体涉及一种测定病毒滴度的方法。
技术介绍
为了在昆虫或哺乳动物体内表达外源基因，通常可采用感染性病毒颗粒感染宿主细胞的方式实现。即，采用插入外源基因的病毒表达载体，导入昆虫细胞或者哺乳动物细胞中，使外源基因表达。常见的病毒表达载体有：昆虫杆状病毒表达载体、腺病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、慢病毒表达载体等等。在提高外源基因表达量方面，优化最适病毒感染量(MOI)是重要手段之一，因此需要精确定量作为表达载体的病毒滴度。目前常用的病毒滴度测定方法包括噬斑法、终点稀释法、酶联免疫法、比色指示剂法、荧光定量PCR方法等。上述方法具体而言：1)噬斑法是测定病毒滴度最经典的方法，主要操作步骤为：接毒后在细胞上铺琼脂凝胶，培养5-8天，计数噬斑，通过噬斑数和稀释度的换算，获得病毒效价。但是，噬斑法操作繁琐，并且要求操作者有一定的操作经验，其应用存在一定的限制。2)终点稀释法的主要操作步骤为：以50％组织培养感染剂量(TCID50)表示，将病毒按照倍比稀释或梯度稀释后接种细胞，培养5-8天，在显微镜下观察细胞病变(CPE)情况，判定各孔是否感染。该方法需要病毒感染细胞，并使细胞出现明显的CPE，再凭经验判断感染与否，因此，在细胞病变并不十分明显的情况下，有漏检的可能，即主观和经验因素对检测结果的影响较大。3)酶联免疫法是利用针对病毒包膜蛋白的特异性抗体，直接标记病毒粒子，以测定病毒滴度。该方法需要的抗体通常价格昂贵，此外，利用此方法测定的病毒包括了复制缺陷的假病毒颗粒，造成滴度估计过高。4)比色指示剂法是通过检测细胞活性，从而间接判断各孔是否感染。在结果判定步骤中引入比色指示剂操作，通过颜色变化判断各孔细胞是否感染病毒。该方法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数，且操作较为繁琐。5)荧光定量PCR方法通过定量病毒核酸而定量病毒，其缺点是需要繁琐的方法提取病毒DNA，且该方法不能区分假病毒颗粒。现有技术中还出现了利用病毒感染细胞后细胞直径的变化来计算病毒滴度的方法：病毒感染细胞后，在细胞内部增殖，从而导致细胞的直径发生变化，通过直径的变化程度测定病毒滴度。但是，专利技术人在对上述方法进行验证的过程中发现，病毒感染后细胞的直径变化实际上并不明显，直径增加通常在10-30％左右，直径变化率较低，导致直径变化前后的测量值过于接近，不仅对测量的精准度提出了较高的要求，其测量的误差也将导致测定病毒的滴度相对于理论真实值产生较大的偏离。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是现有技术中测定病毒滴度的方法操作复杂、对操作者的经验要求较高、测定的准确度及精密度不高，进而提供一种操作简单、易于操作者判断结果、且测量结果准确度高、精密度高的测定病毒滴度的方法。为此，本专利技术提供了一种测定病毒滴度的方法，包括以下步骤：(1)取病毒原液以及若干个不同稀释度的病毒溶液，分别接种于待接病毒的细胞中，培养36-60h，得到不同浓度病毒感染的细胞悬液；所述感染病毒的细胞悬液包括加入病毒原液的无稀释感染细胞悬液、加入各稀释度的病毒溶液的稀释感染细胞悬液；另取所述待接病毒的细胞悬液作为阴性对照液；(2)分别测量步骤1)中所述感染病毒的细胞悬液、以及阴性对照液中细胞的侧向角散射(S)和保持完整细胞形态的细胞密度(C)；(3)按照下述步骤计算病毒滴度：a)按公式：计算细胞感染率Pm,n，m为病毒稀释度编号，n为同一病毒稀释度感染细胞的重复组数编号；其中，所述Sm，n为m号稀释度的病毒第n组感染细胞悬液的细胞侧向角散射的平均值；所述为阴性对照液中细胞的侧向角散射的平均值；所述为无稀释感染细胞悬液中细胞的侧向角散射的平均值；b)按公式：Nm,n＝Cm,n×Pm,n，计算步骤a)中细胞感染率满足20％<Pm,n<80％的所述稀释感染细胞悬液的感染细胞密度Nm,n；c)按公式：Tm,n＝Nm,n/Dm,n，计算步骤b)中各所述稀释感染细胞悬液的病毒滴度Tm,n，取中位值即为病毒原液的病毒滴度；其中，所述Dm,n为所述稀释感染细胞悬液的稀释度。进一步的，所述步骤1)中，接种病毒前，将对数生长期的所述待接病毒细胞以0.6×106至1.0×106个/ml的细胞密度铺到细胞培养板中或加入到细胞悬浮培养瓶中，在27℃-28℃下培养。所述待接病毒的细胞存活率大于95％。所述步骤1)中，所述病毒溶液的稀释度为将细胞感染率大于80％的所述稀释感染细胞悬液进行10倍稀释的稀释度、细胞感染率低于80％的所述稀释感染细胞悬液进行6-8次的对半稀释的稀释度。所述对半稀释，例如第一次对半稀释为将1ml待稀释溶液稀释至2ml，第二次对半稀释为继续将溶液稀释至4ml，第三次对半稀释为继续将溶液稀释至8ml……，以此类推。当然，本领域技术人员知晓，所取的稀释度越多，测定结果的越趋于其理论上的真实值，本领域技术人员可根据实际情况选择稀释度的个数。步骤1)中将所述病毒原液或所述病毒溶液分别接种于待接毒细胞的操作具体为：取等体积的各所述病毒溶液或所述病毒原液，以50％的接种量接种于待接病毒细胞的培养液中，使病毒与细胞的体积比为1:1。需要说明的是，由于上述接种病毒的过程中相当于将所述病毒溶液或所述病毒原液又进行一次稀释，因此，所述步骤c)中代表所述稀释感染细胞悬液的稀释度的Dm,n为接种病毒前所述病毒溶液或所述病毒原液的稀释度乘以50％。所述步骤2)中，采用流式细胞技术测量所述侧向角散射(S)，采用流式技术或细胞计数技术测定细胞密度(C)。所述病毒为杆状病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒中的一种。所述待接病毒细胞为昆虫细胞或哺乳动物细胞。本专利技术中，所述侧向角散射(sidescatter,SSC)是指与激光束正交90°方向的散射光信号。所述稀释度是指溶液被冲淡的程度，即稀释倍数的倒数，例如，1ml的溶质稀释至10倍体积10ml，则稀释度为1：10，即0.1。本专利技术的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：(1)本专利技术的测定病毒滴度的方法，利用病毒感染细胞的侧向角散射的变化测定病毒的滴度。病毒细胞感染细胞后，在细胞内增殖，进而导致细胞内颗粒数增加，同时细胞核也会增大，侧向角散射增加。经验证，感染病毒的细胞的侧向角散射的变化率在40％-100％之间，通常在60％以上，变化极为明显，通过测量不同稀释度病毒感染细胞引起的ΔSSC，经过一系列计算即可测定病毒滴度，避免了现有技术中测定病毒滴度普遍存在的判断结果主观性过强、测定结果不够准确的问题，可以客观的记录数据，其测定结果具有优越的准确度和精密度。(2)本专利技术的测定病毒滴度的方法，仅需在细胞接毒后，测量各细胞悬液的侧向角散射，就可测定病毒的滴度，无需抗体标记、染色技术等操作，不仅简化了操作，且测定成本大大降低，可实现更广泛的应用。(3)本专利技术测定病毒滴度的方法中，所需的最长的时间仅为接毒后进行的36-60h的培养，其余步骤所需时间均较短，相对于噬斑法、终点稀释法等方法所需的至少5-8天的检测时间，大大缩短，可以较快的得到测定结果。附图说明为了使本专利技术的内容更容易被清楚的理解，下面结合附图，对本专利技术作进一步详细的说明，其中，图1是实施例1-5中病毒感染细胞的侧向角散射变化原理图；图2是实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定病毒滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取病毒原液以及若干个不同稀释度的病毒溶液，分别接种于待接病毒的细胞中，培养36‑60h，得到不同浓度病毒感染的细胞悬液；所述感染病毒的细胞悬液包括加入病毒原液的无稀释感染细胞悬液、加入各稀释度的病毒溶液的稀释感染细胞悬液；另取所述待接病毒的细胞悬液作为阴性对照液；(2)分别测量步骤1)中所述感染病毒的细胞悬液、以及阴性对照液中细胞的侧向角散射(S)和保持完整细胞形态的细胞密度(C)；(3)按照下述步骤计算病毒滴度：a)按公式：计算细胞感染率Pm,n，m为病毒稀释度编号，n为同一病毒稀释度感染细胞的重复组数编号；其中，所述Sm,n为m号稀释度的病毒第n组感染细胞悬液的细胞侧向角散射的平均值；所述为阴性对照液中细胞的侧向角散射的平均值；所述为无稀释感染细胞悬液中细胞的侧向角散射的平均值；b)按公式：Nm,n＝Cm,n×Pm,n，计算步骤a)中细胞感染率满足20％<Pm,n<80％的所述稀释感染细胞悬液的感染细胞密度Nm,n；c)按公式：Tm,n＝Nm,n/Dm,n，计算步骤b)中各所述稀释感染细胞悬液的病毒滴度Tm,n，取中位值即为病毒原液的病毒滴度；其中，所述Dm,n为所述稀释感染细胞悬液的稀释度。...

【技术特征摘要】
1.一种测定病毒滴度的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取病毒原液以及若干个不同稀释度的病毒溶液，分别接种于待接病毒的细胞中，培养36-60h，得到不同浓度病毒感染的细胞悬液；所述感染病毒的细胞悬液包括加入病毒原液的无稀释感染细胞悬液、加入各稀释度的病毒溶液的稀释感染细胞悬液；另取所述待接病毒的细胞悬液作为阴性对照液；(2)分别测量步骤1)中所述感染病毒的细胞悬液、以及阴性对照液中细胞的侧向角散射(S)和保持完整细胞形态的细胞密度(C)；(3)按照下述步骤计算病毒滴度：a)按公式：计算细胞感染率Pm,n，m为病毒稀释度编号，n为同一病毒稀释度感染细胞的重复组数编号；其中，所述Sm,n为m号稀释度的病毒第n组感染细胞悬液的细胞侧向角散射的平均值；所述为阴性对照液中细胞的侧向角散射的平均值；所述为无稀释感染细胞悬液中细胞的侧向角散射的平均值；b)按公式：Nm,n＝Cm,n×Pm,n，计算步骤a)中细胞感染率满足20％<Pm,n<80％的所述稀释感染细胞悬液的感染细胞密度Nm,n；c)按公式：Tm,n＝Nm,n/Dm,n，计算步骤b)中各所述稀释感染细胞悬液的病毒滴度Tm,n，取中位值即为病毒原液的病毒滴度；其中，所述Dm,n为所述稀释感染细胞悬液的稀释度；所述病毒为杆状病毒、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒中的一种；所述待接病毒细胞为昆虫细胞或哺乳动物细胞。2.根据权利要求1所述的测定病毒滴度的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，接种病毒前，将对数生长期的所述待接病毒细胞以0.6×106至1.0×106个/ml的细胞密度铺到细胞培养板中或加入到细胞悬...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁静，刘涛，张春，潘俊杰，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32