一种同时检测BP、MBV、HPV的三色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种同时检测BP、MBV、HPV的三色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒。本发明专利技术检测试剂盒含有特异性引物和探针，通过反应体系和条件的优化，一次试验可同时高灵敏、高特异地检测出BP、MBV和HPV，具有很好的特异性、敏感性和重复性；可特异性地检测BP、MBV和HPV，与中肠腺坏死杆状病毒、HPV、WSSV、IHHNV等病毒的不发生交叉反应；检测限达103拷贝/µl；重复性较好；本发明专利技术的检测方法是BP、MBV和HPV病毒快速初筛及初步确认定型的良好方法。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测BP、MBV、HPV的三色荧光定量PCR联合检测方法及其试剂盒
本专利技术涉及一种同时检测对虾杆状病毒（BaculovirusPenaeivirus,BP）、斑节对虾杆状病毒（MonodonBaculovirus,MBV）、肝胰腺细小病毒（HepatopancreaticParvovirus,HPV）的方法，具体涉及一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法及试剂盒。
技术介绍
对虾杆状病毒病是一种对虾的肝胰腺或中肠上皮细胞核内由于感染多角体杆状病毒而引起的多种对虾的急性传染病，对桃红对虾、褐对虾（P.aztecus）、万氏对虾（P.vannami）和缘沟对虾（P.marginatus）等主要商业虾类有较大危害，可引起对虾幼体几乎100%死亡。对虾杆状病毒属杆状病毒科A亚群，具囊膜，大小为74×270nm，核衣壳约50nm，含双股DNA。该病毒能感染多种对虾的肝胰腺和中肠上皮细胞，并只在细胞核内复制，产生多个金字塔状的核内包涵体。这种包涵体从锥顶到底面高0.5-20μm，大多数是8-10μm，由晶格排列的多角体蛋白亚单位构成。病毒颗粒在包涵体内。目前检测对虾杆状病毒的方法主要是依据SN/T1151.5-2003的标准进行PCR-电泳法检测。斑节对虾杆状病毒最初由Lightner和Redman从来自台湾的种虾中发现，但实际上自1976年在台湾、菲律宾和南太平洋的塔希提岛（Tahiti）等国家和地区已相继出现此病。已知的如中国、泰国、新加坡、印度尼西亚、马来西亚都有广泛的分布。严重感染幼体能引起大量死亡，更因继发感染其它病毒、细菌或附生物而导致幼体大批量死亡。斑节对虾杆状病毒属于杆状病毒科，杆状病毒属A亚群。病毒为杆状，有囊膜，含双链DNA，核衣壳大小为42×246nm，连囊膜大小约为75×324nm。不同种类的虾观察到的病毒颗粒大小略有差异。病毒在细胞核内复制，能产生大量直径0.5-8μm的圆形或椭圆形多角体，病毒则多被包果其中。目前检测斑节对虾杆状病毒的方法主要是肝胰脏直接染色压片法检测，或依据SC-T7202.2-2007、SNT1151.3-2002的标准进行PCR-电泳法检测。肝胰腺细小病毒主要感染对虾之后尾幼虫（postlarvae）及稚虾，一般病虾外观无明显特异症状，幼体虾被感染后行动不活泼、食欲减退、生长缓慢、很少蜕皮，体表常有许多共栖性生物或杂物附着;养殖期的幼虾或成虾，虾体瘦弱、体色较深，有些罹病虾体甲壳表面有大量黑色斑点，有时甲壳变软、腹部肌肉变白，抗逆性能力差，常并发二次性细菌感染，以弧菌（Vibriospp.）最常见，有时罹病虾体除继发性细菌感染外被感染的草虾（P.monodon）常可检出草虾杆状病毒（Monodonbaculovirus,MBV=PmSNPV）及白斑综合症候群病毒（whitespotsyndromevirus,WSSV）。（UmeshaRKetal,2003,R），造成甚大的死亡，其死亡率达50～90％，并随着虾体增长，病情减轻;种虾多呈隐性感染而带病毒。虾肝胰腺细小病毒感染之靶的器官为肝胰腺管远盲端上皮Ｅ细胞及前中肠后段上皮细胞，并在细胞核内进行复制，且破坏组织细胞。肝胰腺细小病毒为单股DNA病毒(Single-StrandDNA)，在细胞核内增殖并形成圆形或卵圆形包涵体(inclusionbody)，经Feulgen氏染色呈阳性反应，病毒颗粒大小随感染虾种而有差异;如感染草虾肝胰腺病毒颗粒为22-24nm（Lightner&Redman,1985）、感染巴拿马对虾（bananashrimp,Penaeus=Fenneropenaeusmerguiensis），肝胰腺病毒颗粒为21-22nm（Roubaletal.1989）、感染斑节虾（kurumashrimp,P.=Marsupenaeusjaponicus）、肝胰腺病毒颗粒为17-20nm（Spannetal,1997），平均病毒颗粒为22-24µm。目前检测肝胰腺细小病毒的方法主要为SC/T7203.1-2007中的PCR-电泳法。基于taqman探针的荧光定量PCR技术，通过荧光标记的探针，实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，该方法操作方便快捷。相比组织病理学的检测或者PCR-电泳法检测的方法，灵敏度高、特异性高，可以更有效地检测出携带病毒的对虾。探针法不仅可以在2小时内完成检测，且闭管操作，可以有效地防范PCR产物的污染。探针法是通过荧光信号进行检测的，通过加入不同的染料，在不同波长的激发光下，可以产生不同波长的荧光。通过对探针标记FAM、VIC、JOE、NED、HEX等不同的染料，可以检测同一次荧光定量PCR扩增试验中同时扩增的多个目的基因。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测方法。本专利技术的另一目的在于提供一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒。本专利技术所采取的技术方案是：一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCRMIX、病毒核酸提取液、热启动Taq酶阳性质控品、阴性质控品，所述多色荧光定量PCRMIX中含有同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的的特异性引物及探针，序列分别为：对虾杆状病毒的上游引物：BP-F：5’-AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA-3’（SEQIDNO：1）；下游引物：BP-R：5’-CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA-3’（SEQIDNO：2）；荧光探针：BP-P：5’-TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA-3’（SEQIDNO：3）；斑节对虾杆状病毒的上游引物：MBV-F：5’-TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA-3’（SEQIDNO：4）；下游引物：MBV-R：5’-AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT-3’（SEQIDNO：5）；荧光探针：MBV-P：5’-CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG-3’（SEQIDNO：6）；肝胰腺细小病毒的上游引物：HPV-F：5’-CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’（SEQIDNO：7）；下游引物：HPV-R：5’-AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’（SEQIDNO：8）；荧光探针：HPV-P：5’-TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’（SEQIDNO：9）。进一步的，上述多色荧光定量PCRMIX中含有5mMMgCl2，50mMTris，100mMKCl，400mMdNTP，0.1mg/mLGP32蛋白，400nMBP-F、400nMBP-R、400nMMBV-F、400nMMBV-R、400nMBMNV-F、400nMBMNV-R、400nMHPV-F、HPV-R，240nMBP-P、240nMMBV-P、240nMBMNV-P、240n本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCR MIX、病毒核酸提取液、热启动Taq酶阳性质控品、阴性质控品，其特征在于：所述多色荧光定量PCR MIX中含有同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的的特异性引物及探针，序列分别为：对虾杆状病毒的上游引物：BP‑F：5’‑ AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA ‑3’（SEQ ID NO：1）；下游引物：BP‑R：5’‑ CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA ‑3’（SEQ ID NO：2）；荧光探针：BP‑P：5’‑ TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA ‑3’（SEQ ID NO：3）；斑节对虾杆状病毒的上游引物：MBV‑F：5’‑ TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA ‑3’（SEQ ID NO：4）；下游引物：MBV‑R：5’‑ AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT ‑3’（SEQ ID NO：5）；荧光探针：MBV‑P：5’‑ CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG ‑3’（SEQ ID NO：6）；肝胰腺细小病毒的上游引物：HPV‑F：5’‑CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT‑3’（SEQ ID NO：7）；下游引物：HPV‑R：5’‑AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT‑3’（SEQ ID NO：8）；荧光探针：HPV‑P：5’‑TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC‑3’（SEQ ID NO：9）。...

【技术特征摘要】
1.一种同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的三色荧光定量PCR联合检测试剂盒，包括如下成分：多色荧光定量PCRMIX、病毒核酸提取液、热启动Taq酶、阳性质控品、阴性质控品，其特征在于：所述多色荧光定量PCRMIX中含有同时检测对虾杆状病毒、斑节对虾杆状病毒、肝胰腺细小病毒的特异性引物及探针，序列分别为：对虾杆状病毒的上游引物：BP-F：5’-AACCTGACCTCCTCCAAACTTTTA-3’（SEQIDNO：1）；下游引物：BP-R：5’-CCCAAAATTCTAGAGCCTCCAA-3’（SEQIDNO：2）；荧光探针：BP-P：5’-TCAGGCTGGACCAGATGTCCCAAAA-3’（SEQIDNO：3）；斑节对虾杆状病毒的上游引物：MBV-F：5’-TTGCTCCAAAAAGAGTTCTTCCA-3’（SEQIDNO：4）；下游引物：MBV-R：5’-AAGGGTGTATGCTAGCCTATGGTAGT-3’（SEQIDNO：5）；荧光探针：MBV-P：5’-CATTTCCTTTATATTCCAATCGCGTCTGCG-3’（SEQIDNO：6）；肝胰腺细小病毒的上游引物：HPV-F：5’-CTGGAGTAAAAGTAGCAAGAGGGTTT-3’（SEQIDNO：7）；下游引物：HPV-R：5’-AGTCTTGCCATAGTTGCTTGTTGT-3’（SEQIDNO：8）；荧光探针：HPV-P：5’-TCCGAGGCTACGAGAAGATCCTGCAAC-3’（SEQIDNO：9）。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述多色荧光定量PCRMIX中含有5mMMgCl2，50mMTris，100mMKCl，400mMdNTP，0.1mg/mLGP32蛋白，400nMBP-F、400nMBP-R、400nMM...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓玮，邓武，
申请(专利权)人：广州维伯鑫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44