本发明专利技术公开了一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法，特点是LAMP的两对引物如下MCMV2-F3、MCMV2--B3、MCMV2-FIP、MCMV2-BIP，其RT-LAMP反应体系如下：2μL MCMV2-FIP溶液，2μL MCMV2-BIP溶液，0.25μL MCMV2-F3溶液，0.25μL MCMV2-B3 溶液，12.5μL 2×反应缓冲液，1μLBst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶混合液，1μL钙黄绿素，2.5μL RNA模板，无RNA酶的水补至25 μL，检测方法包括总RNA的提取；RT-LAMP引物的设计和合成；配制 RT-LAMP 反应体系；MCMV的RT-LAMP目视检测，优点是灵敏度高，特异性强且简便快速。
【技术实现步骤摘要】
玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法
本专利技术涉及玉米褪绿斑驳病毒的检测技术，尤其是涉及玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
玉米褪绿斑驳病毒(Maizechloroticmottlevirus，MCMV)属番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，1974年首次在秘鲁发现，1976年美国相继报道该病毒的发生，现在主要分布于美国、阿根廷、墨西哥及秘鲁等地。该病毒主要通过昆虫、种子携带、机械传播等方式蔓延扩散。其中种子带毒是远距离传播的重要途径，且种子传毒率与种子的质量无相关关系。甲虫和蓟马等昆虫是该病毒扩散的主要介体，世界范围广泛分布的甲虫和蓟马为其快速传播提供了便利条件。该病毒侵染玉米所引发的病害可导致玉米减产10％～15％，若与玉米褪绿斑驳病毒、甘蔗花叶病毒或玉米矮花叶病毒复合侵染，有可能造成平均高达75％的产量损失。鉴于MCMV的高风险性，我国在2007年颁布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为检疫性病毒。2009年，龚海燕等从青岛口岸进境的美国大豆种子种混杂的玉米粒上检出该病毒，2011年，刘洪义等从黑龙江口岸邮寄进境的德国玉米种子也检出该病毒。目前，玉米褪绿斑驳病毒的检测主要采用生物学、血清学和RT-PCR方法，这些方法的弊端在于耗时长，依赖昂贵的检测设备。环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)技术是Notomi等2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，该技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一个具有链置换特性的DNA聚合酶(BstDNApolymerase)，在等温条件下高效扩增靶基因，灵敏度和特异性高。该方法已应用于病毒、类病毒、细菌、真菌及转基因的检测。而迄今尚无应用该技术检测玉米褪绿斑驳病毒的报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高，特异性强且简便快速的玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：1、一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组，LAMP的两对引物序列如下：外侧上游引物MCMV2-F3：TACATTTCCATGGCATTCCT；外侧下游引物MCMV2-B3：GTAGGATTGCTGCTCCACG；内侧上游引物MCMV2-FIP：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG；内侧下游引物MCMV2-BIP：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。2、一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，由BstDNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均为20μmol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液，钙黄绿素荧光染料(购自Eiken公司，商品名为FluorescentDetectionReagent)，所述的2×反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引物溶液、所述的内侧下游引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、所述的钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，引物序列为内侧上游引物MCMV2-F3：TACATTTCCATGGCATTCCT；内侧下游引物MCMV2-B3：GTAGGATTGCTGCTCCACG；外侧上游引物MCMV2-FIP：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG；外侧下游引物MCMV2-BIP：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8.8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgSO4、20mM的(NH4)2SO4、0.2％的Tween20、1.6M的甜菜碱和每种2.8mM的dNTPS，所述的聚合酶混合液中BstDNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8U/μL。3、一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：(1)总RNA的提取将玉米待测样本使用RNeasyPlantMiniKit进行植物总RNA提取，具体操作见试剂盒说明书；(2)RT-LAMP引物的设计和合成从GenBank调出所有玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN6.0.40软件进行比对分析，找出MCMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件PrimerExplorerV4设计特异性引物并通过引物筛选获得RT-LAMP检测的最佳引物：外侧上游引物MCMV2-F3：TACATTTCCATGGCATTCCT；外侧下游引物MCMV2-B3：GTAGGATTGCTGCTCCACG；内侧上游引物MCMV2-FIP：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG；内侧下游引物MCMV2-BIP：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG；(3)配制RT-LAMP反应体系浓度为20μmol/L的内侧上游引物溶液和内侧下游引物溶液各2μL，浓度为20μmol/L的外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液各0.25μL，12.5μL2×反应缓冲液，由BstDNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液1.0μL，钙黄绿素荧光染料1.0μL，样品总RNA2.5μL，无RNase的水补至25μL；(4)MCMV的RT-LAMP目视检测将上述反应体系进行扩增反应，反应条件为：61℃70min，95℃2min；RT-LAMP扩增结束后，在正常光照条件下，通过裸眼观察反应管中颜色的变化来准确判定结果，若扩增产物呈黄绿色，则样品感染玉米褪绿斑驳病毒。所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8.8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgSO4、20mM的(NH4)2SO4、0.2％的Tween20、1.6M的甜菜碱和每种2.8mM的dNTPS，所述的聚合酶混合液中BstDNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8U/μL。原理说明：钙黄绿素是一种螯合剂，反应前与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态，LAMP扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿色荧光，通过观察荧光的有无可判断是否有扩增。与现有技术相比，本专利技术的优点在于：本专利技术首次公开了玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法，根据玉米褪绿斑驳病毒(MCMV)外壳蛋白基因序列的保守区设计RT-LAMP特异性引物，该引物组具有特异性强，灵敏度高达20pg，与RT-PCR相当，而反应时间明显缩短，整个检测1小时内可完成，提高了扩增效率，这与引物本身的质量(如长度、GC含量)、退火温度、反应体系中金属离子的浓度、酶的活性等因素直接有关。通过在反应体系中预先加入螯合剂——钙黄绿素，可实现肉眼观察判定结果，尤其适合设备资源配置简单的口岸实验室开展现场快本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组， LAMP的两对引物序列如下：外侧上游引物 MCMV2‑F3 ：TACATTTCCATGGCATTCCT；外侧下游引物 MCMV2‑B3：GTAGGATTGCTGCTCCACG；内侧上游引物MCMV2‑FIP：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG；内侧下游引物MCMV2‑BIP：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
【技术特征摘要】
1.一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒包括2×反应缓冲液，由BstDNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均为20μmol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液，钙黄绿素荧光染料，所述的2×反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引物溶液、所述的内侧下游引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、所述的钙黄绿素荧光染料的体积比为12.5：1：2：2：0.25：0.25：1，引物序列为内侧上游引物MCMV2-F3：TACATTTCCATGGCATTCCT；内侧下游引物MCMV2-B3：GTAGGATTGCTGCTCCACG；外侧上游引物MCMV2-FIP：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG；外侧下游引物MCMV2-BIP：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG；所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8.8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的MgSO4、20mM的(NH4)2SO4、0.2％的Tween20、1.6M的甜菜碱和每种2.8mM的dNTPS，聚合酶混合液中BstDNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8U/μL。2.一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤：(1)总RNA的提取将玉米待测样本使用RNeasyPlantMiniKit进行植物总RNA提取；(2)RT-LAMP引物的设计和合成从GenBank调出所有玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN6.0.40软件进行比对分析，找出MCMV外壳蛋白...
【专利技术属性】
技术研发人员：徐颖，郑炜，徐亚飞，刘永丰，黄世杰，邱志君，
申请(专利权)人：中华人民共和国北仑出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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