一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法。本发明专利技术利用基因工程技术部分或全部失活微生物占主要的次级代谢产物的生物合成基因簇，从而使微生物不产或极少产对应次级代谢产物，获得相对简单的次级代谢产物背景，然后通过培养条件的改变或遗传改造，使原本不表达或低量表达的次级代谢产物的产量显著提高，成为主要次级代谢产物，并利用化学或生物活性分析等方法进行检测，直至发现若干新的次级代谢产物。本发明专利技术能够显著提高隐性次级代谢产物生物合成基因簇激活和产物检出的成功率，为从大量的微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇中挖掘新的活性物质提供了新的有效途径。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于微生物学和基因工程
，具体涉及一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法。
技术介绍
：多重耐药菌的产生和传播，新病原菌不断出现以及高效低毒抗癌药物的匮乏，使创制和发展抗感染、抗癌新药成为一项非常必要和紧迫的工作。微生物次级代谢产物作为重要的天然产物在现代药物发现和发展过程中扮演着极其重要的角色，是药物创新的重要途径和来源[ButlerMS,etal.,NaturalProductReports,2014,31:1612-1661]。但在历经数十年的挖掘之后，高频率的重复发现严重影响了活性天然产物的筛选效率，利用传统方法从放线菌等药源微生物中筛选新的活性天然产物，特别是作用机制新颖的活性天然产物变得越来越困难，国际制药公司在进入新世纪前纷纷放弃传统天然产物的筛选工作[LiJW-H,etal.,Science,2009,325:161-165]。而随着天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)A3(2)和阿维链霉菌(S.avermitilis)基因组测序的完成，人们发现链霉菌基因组中存在众多的次级代谢产物生物合成基因簇，潜在的次级代谢产物远远多于目前已发现的数量，这意味着放线菌中仍有许多新的活性次级代谢产物有待被发现，为人们进一步从中挖掘新的活性天然产物提供了理论依据。而新一代测序技术的出现使大量隐性次级代谢产物生物合成基因簇不断累积，将为天然产物的挖掘开启第二次黄金时代。然而如何利用这些大量的隐性基因簇来获取新的活性天然产物是当前面临的重要难题。目前文献报道的激活隐性基因簇的方法主要包括“一菌多素”(onestrain/manycompounds，OSMAC)[BodeHB,etal.,Chembiochem,2002,3:619-627]、种间串扰(共培养)[Mearns-SpraggA,etal.,LettersinAppliedMicrobiology,1998,27:142-146]和核糖体工程[ShimaJ,etal.,JournalofBacteriology,1996,178:7276-7284]以及异源表达、启动子改造等。一菌多素、种间串扰(共培养)和核糖体工程等方法，主要依赖过往的经验以及精巧的设计，但对结果很难做出预测和事前的理性设计，效率低下；异源表达、启动子改造等方法，则需要对产生菌的遗传背景和代谢调控网络有足够清晰的认识，普适性低。因此，本领域迫切需要更加有效的方法来激活隐性次级代谢产物生物合成基因簇。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于提供一种效率有所提高的激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法。一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)简化微生物的次级代谢产物背景；(2)改变培养条件或对目标隐性次级代谢产物生物合成基因簇进行遗传改造，使隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达；(3)检测分析培养物中的次级代谢产物；(4)重复步骤(1)～(3)若干次，直至发现若干新的次级代谢产物；所述的微生物，其基因组或质粒DNA中包含至少1个主要次级代谢产物生物合成基因簇和至少1个隐性次级代谢产物生物合成基因簇。优选，所述的主要次级代谢产物生物合成基因簇为在常规培养条件下大量表达的次级代谢产物生物合成基因簇，所述的隐性次级代谢产物生物合成基因簇为在常规培养条件下不表达或低量表达的次级代谢产物生物合成基因簇。优选，所述的简化微生物的次级代谢产物背景具体为利用基因工程技术将微生物基因组或质粒DNA中至少1个主要次级代谢产物生物合成基因簇中部分或全部基因失活，获得在常规培养条件下不再或很少产生对应次级代谢产物的微生物突变体。优选，所述的微生物为基因组或质粒DNA上含有聚酮合酶途径和非核糖体多肽合成酶途径生物合成基因簇、含有聚酮合酶途径和PKS-NRPS杂合途径生物合成基因簇、含有非核糖体多肽合成酶途径和PKS-NRPS杂合途径生物合成基因簇或含有聚酮合酶途径、非核糖体多肽合成酶途径和PKS-NRPS杂合途径生物合成基因簇，且至少1个上述的生物合成基因簇为主要次级代谢产物生物合成基因簇和至少1个上述的生物合成基因簇为隐性次级代谢产物生物合成基因簇。另外，本专利技术的微生物可以优选地举出原核生物、更优选地举出细菌。细菌可以选自、但不限于下述属的微生物：链霉菌属(Streptomyces)、糖单孢菌属(Saccharomonospora)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)、拟无枝酸菌属(Amycolatopsis)、棒杆菌属(Corynebacterium)、小单孢菌属(Micromonospora)、拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、诺卡氏菌属(Nocardia)、冢村氏菌属(Tsukamurella)、高温放线菌属(Thermoactinomyces)、异壁放线菌属(Actinoalloteichus)、北里孢菌属(Kitasatospora)、链嗜酸菌属(Streptacidiphilus)、红色杆菌属(Rubrobacter)、戈登氏杆菌属(Gordonibacter)、链孢囊菌属(Streptosporangium)、小双孢菌属(Microbispora)、小四孢菌属(Microtetraspora)、野野村氏菌属(Nonomuraea)、游动单孢菌属(Planomonospora)、游动双孢菌属(Planobispora)、草孢菌属(Herbidospora)、游动四孢菌属(Planotetraspora)、高温多孢菌属(Thermopolyspora)、南海海洋所菌属(Sciscionella)、链单孢菌属(Streptomonospora)、盐放线孢菌属(Haloactinospora)、海洋放线孢菌属(Marinactinospora)、放线孢菌属(Actinomycetospora)、高温单孢菌属(Thermomonospora)、马杜拉放线菌属(Actinomadura)、螺孢菌属(Spirillospora)、珊瑚放线菌属(Actinocorallia)、高温双孢菌属(Thermobispora)、盐孢菌属(Salinispora)、疣孢菌属(Verrucosispora)、海孢菌属(Marinispora)、假单胞菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、Byssovorax、堆囊菌属(Sorangium)、粘球菌属(Myxococcus)、原囊菌属(Archangium)和软骨霉状菌属(Chondromyces)。另外，属于上述属的细菌可以选自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)、吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)、粤蓝链霉菌(Streptomycesvietnamensis)、灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)、白色链霉菌(Streptomycesalbus)、龟裂链霉菌(Streptomycesrimosus)、娄彻氏链霉菌(Strepto本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)简化微生物的次级代谢产物背景；(2)改变培养条件或对目标隐性次级代谢产物生物合成基因簇进行遗传改造，使隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达；(3)检测分析培养物中的次级代谢产物；(4)重复步骤(1)～(3)若干次，直至发现若干新的次级代谢产物；所述的微生物，其基因组或质粒DNA中包含至少1个主要次级代谢产物生物合成基因簇和至少1个隐性次级代谢产物生物合成基因簇。

【技术特征摘要】
1.一种激活微生物隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)简化微生物的次级代谢产物背景；(2)改变培养条件或对目标隐性次级代谢产物生物合成基因簇进行遗传改造，使隐性次级代谢产物生物合成基因簇表达；(3)检测分析培养物中的次级代谢产物；(4)重复步骤(1)～(3)若干次，直至发现若干新的次级代谢产物；所述的微生物，其基因组或质粒DNA中包含至少1个主要次级代谢产物生物合成基因簇和至少1个隐性次级代谢产物生物合成基因簇。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的主要次级代谢产物生物合成基因簇为在常规培养条件下大量表达的次级代谢产物生物合成基因簇，所述的隐性次级代谢产物生物合成基因簇为在常规培养条件下不表达或低量表达的次级代谢产物生物合成基因簇。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的简化微生物的次级代谢产物背景具体为利用基因工程技术将微生物基因组或质粒DNA中至少1个主要次级代谢产物生物合成基因簇中部分或全部基因失活，获得在常规培养条件下不再或很少产生对应次级代谢产物的微生物突变体。4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的微生物为基因组或质粒DNA上含有聚酮合酶途径生物合成基因簇、非核糖体多肽合成酶途径生物合成基因簇和PKS-NRPS杂合途径生物合成基因簇的两种或三种，且至少一个上述的生物合成基因簇为主要次级代谢产物生物合成基因簇和至少1个上述的生物合成基因簇为隐性次级代谢产物生物合成基因簇。5.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的微生物选自链霉菌属、糖单孢菌属、糖多孢菌属、拟无枝酸菌属、棒杆菌属、小单孢菌属、拟诺卡氏菌属、假诺卡氏菌属、诺卡氏菌属、冢村氏菌属、高温放线菌属、异壁放线菌属、北里孢菌属、链嗜酸菌属、红色杆菌属、戈登氏杆菌属、链孢囊菌属、小双孢菌属、小四孢菌属、野野村氏菌属、游动单孢菌属、游动双孢菌属、草孢菌属、游动四孢菌属、高温多孢菌属、南海海洋所菌属、链单孢菌属、盐放线孢菌属、海洋放线孢菌属、放线孢菌属、高温单孢菌属、马杜拉放线菌属、螺孢菌属、珊瑚放线菌属、高温双孢菌属、盐孢菌属、疣孢菌属、海孢菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、Byssovorax、堆囊菌属、粘球菌属、原囊菌属和软骨霉状菌属。6.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述的微生物选自天蓝色链霉菌、除虫链霉菌、吸水链霉菌、粤蓝链霉菌、灰色链霉菌、白色链霉菌、龟裂链霉菌、娄...

【专利技术属性】
技术研发人员：邓名荣，朱红惠，王燕，林海州，郭俊，李燕旋，陈美标，王永红，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，广东博沃特生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44