本发明专利技术涉及真菌次级代谢功能改造相关实验技术及其用途，具体涉及ＤＭＳＯ介导的真菌次级代谢功能改造实验技术方法以及该技术方法用于无活性真菌野生株的转化和筛选获取抗肿瘤、抗病原真菌等活性突变株并供药源活性产物研究的用途。本发明专利技术的方法可以有效地用于从一种真菌例如无活性真菌改造成为工业可用的真菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及真菌次级代谢功能改造相关实验技术，具体涉及DMSO介导的真菌次 级代谢功能改造实验技术方法，以及该技术方法用于无活性真菌野生株的转化和筛选获取 抗肿瘤、抗病原真菌等活性突变株并供药源活性产物研究的用途。
技术介绍
微生物产物是新药及其先导结构的一个重要来源，而可分离培养微生物迄今一直 是微生物药物及其先导结构的主要来源和主流研发资源。通常，在可分离培养微生物的药 源菌株资源常规研发过程中，分离得到的绝大多数菌株往往因无活性而不能直接用于药源 活性产物研究，因而被大量闲置或被选择销毁，造成前期投入的极大浪费和菌株资源开发 利用效率严重低下。因此，如何将大量闲置无用的无活性菌株有效转化成活性菌株从而拓 展药源微生物资源已成为重要研究课题。近几年微生物基因组学研究结果表明，微生物基因组序列所含次级代谢产物 生合成基因簇或基因远比其已知生产的产物多(如文献S.D.Bentley，et al. Complete genome sequence of the modelactinomycete Streptomyces coelicolor A3 (2). Nature,2002,417 :141-147 ； 文 献 H. Ikeda, et al. Completegenome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis. NatBiotechnol, 2003,21 (5) :526_531 ；文献M. Oliynyk, et al. Complete genome sequence of theerythromycin-producing bacterium Sacchropolyspora erthraea NRRL23338. Nat Biotechnol, 2007 (4) :447_453 ；文献 Y. Ohnishi, et al. Genome sequence of the streptomycin-producing microorganismStreptomyces griseus IFO 13350. J Bcteriol, 2008,190(11) :4050-4060等所记载)，因而具备合成更多次级产物的潜在能力(参见 文 献 S.Donadio, et al.Impact of the first Streptomyces genome sequence on thediscovery and production of bioactive substances. Appl Microbiol Biotechnol, 2002,60 :377_380 以及文献 H. B. Bode, et al. The impact of bacterial genomics on natural product research. Angew Chem Int Ed，2005，44 (12) :6828_6846 所记述相关内 容)。因此，无活性菌株具有转化成活性菌株的基因组基础，只要所采用的方法得当，完全有 可能实现有效转化并从中发现药源活性化合物，从而拓展药源微生物新菌株资源。这也正 是下述无活性放线菌具有活性化转化潜能的基因组基础，而核糖体工程技术则是激发放线 菌这种潜能的一种简便有效手段。微生物核糖体具有调控次级代谢的功能，通过干预和改变核糖全这些功能，可 改造微生物次级代谢，从而挖掘利用微生物的相关有用潜能。核糖体工程(参见文献 K. Ochi, et al. Ribosome engineeringand secondary metabolite production. Advan Appl Microbiol，2004，56 :155_184 以及文献 Ochi K. From microbial differentiation to ribosome engineering. Biosci Biotechnol Biochem，2007，71 (6) : 1373-1386 记载) 相关研究表明，无活性放线菌野生菌株可通过抗生素抗性筛选转化为活性突变株(参见文献“于志斌，等.利用核糖体工程技术开拓海洋微生物药用资源的研究.高技术通讯，2005， 15(5) :87-90”以及文献“孙玉雯，等.海洋微生物的分离培养及其野生型与突变型抗肿瘤 活性菌株的筛选.军事医学科学院院刊，2008，32 (6) :532-536”的相关内容)，而转化获取 的活性突变株可用于突变株新产药源活性产物研究，从而有效拓展微生物药源活性新菌株 资源(参见文献“于志彬，等.用核糖体工程技术二次开发海洋微生物菌株资源的研究.高 技术通讯，2006，16 (11) :1190-1194”以及文献“韩晓，等.放线菌野生株代谢功能的核糖体 工程改造与新产抗肿瘤活性产物研究.国际药学研究杂志，2009，36(6) :435-442&446”中 相关内容)。真菌是核糖体工程研究至今尚未触及的一类微生物，不仅与核糖体功能相关真菌 核糖体工程研究至今未见文献报道，而且有关无活性真菌野生株的活性化转化相关研究尤 其是有关本专利技术涉及的改造真菌次级代谢功能的实验技术方法及其用于无活性真菌野生 株的转化和筛选获取抗肿瘤、抗病原真菌等活性突变株并用于筛选药源活性产物的研究尚 未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种有效的真菌次级代谢功能改造相关实验技术和/或方 法及其用途。本专利技术人曾尝试采用常规核糖体工程实验技术方法，选用作用于核糖体的各 种抗生素，对真菌探索开展了改造次级代谢功能相关抗性筛选实验。但由于细胞壁的特殊 结构，作用于核糖体的抗生素无法透过真菌细胞壁进入到作用部位，因此利用常规的核糖 体工程抗性筛选方法，根本无法筛选得到次级代谢功能获得改造的真菌抗生素抗性突变 株。在此基础上，本专利技术通过系统考查冷冻、高温、超声、微波、pH、乙酸乙酯、丙酮、 DMS0、甲醇、乙醇、丁醇等多种理化学因素对真菌细胞壁膜通透性的影响以及组合链霉素、 氯霉素、新霉素、利福平、庆大霉素、卡那霉素等多种抗生素和/或亚硝基胍(NTG)、硫酸二 乙酯(DES)、超声、微波、紫外等多种物理化学诱变因子共同作用对真菌次级代谢的影响，摸 索到了可人为改造真菌次级代谢的组合实验条件，并建立了 DMSO介导的抗生素抗性筛选、 DMSO介导的人工化学诱变等改造真菌次级代谢功能的实验技术方法。同时，利用该实验技 术方法，成功转化无活性真菌野生菌株，高效筛选获得了具有抗肿瘤、抗病原真菌等生物活 性的活性突变株，研究阐明了活性突变株新产活性产物，并在此过程中研究建立了通过与 原始菌发酵产物直接对照比较，快速跟踪分离活性突变株新产活性产物的分离提纯制备方 法。本专利技术的研究结果表明，本专利技术有关改造真菌次级代谢功能的实验技术方法可用于有 效改造无活性真菌野生株的次级代谢功能，并从中高效转化获取药源活性突变株，从而有 效拓展真菌药源活性新菌株资源，同时通过系统阐明突变株新产活性产物，还可以深入开 发利本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种ＤＭＳＯ介导的改造真菌次级代谢功能的方法，其特征是，在ＤＭＳＯ溶液中，将被处理原始真菌与可作用于微生物核糖体发挥抗菌作用的抗生素相互作用０．５～２００天的期间，并在该期间适时取样，经ＰＤＡ平板涂板和反复的单菌落挑选与分离培养，纯化得到次级代谢功能获得改造的突变株。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：崔承彬，吴长景，田从魁，柴云晶，卜秀嫣，房士明，李长伟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所，
类型：发明
国别省市：11
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