阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法技术

本发明专利技术为阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变方法及辐照菌种的培养，涉及微生物菌种选育的领域，阿佛曼链霉菌种用现有的诱变方法发酵效价达到４０００微克／毫升，再提高已非常困难，为此本发明专利技术采用１２Ｃ＋６重离子束辐照进行诱变，辐照剂量４０－７０Ｇｙ，优选辐照剂量５０Ｇｙ，进行平板培养基及斜面培养基的正突变菌株筛选，发酵效价可达到６０００微克／毫升，得到高效价菌种，本发明专利技术具有变异稳定、快速、突变容易控制、方法简便易行的有益效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物菌种选育的领域，尤其是采用重离子12C+6辐照诱变。
技术介绍
优良的微生物菌种是发酵工业的基础和关键，要使发酵工业产品的种类、产量和质量有较大的改善，首先必须选育性能优良的生产菌种。目前常用的发酵微生物菌种选育技术， 一种是常规的诱变育种方法，另一种是分子育种方法。常规的诱变育种方法采用物理诱变因子如紫外线等进行诱变育种，或者采用化学诱变因子如硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍、氯化锂、香豆素等进行诱变育种，或者采用物理因子和化学因子的复合诱变育种。常规育种具有盲目性强，工作量大、成功率低，而且现有的生产菌种对以往常用的物理和化学方法均表现出不同的抗性。分子育种方法是采用原生质体融合技术和DNA重组技术等一系方法选育菌种，该方法操作难度大，而且由于发酵工业生产规模大，基因工程菌经反扩大培养很容易引起质粒失活甚至丢失，造成基因表达困难。因此寻找新的诱变育种方法是迫切要解决的问题。 阿维菌素是当今最受关注的生物杀虫杀螨剂之一，是被推荐使用的高效低毒农药，阿维菌素(Avermectin)是由阿佛曼链霉素经液体发酵加工而成，与传统农、兽药相比，具有高效、广谱、剂量小、适口性好、有效期长、不易产生抗药性，易降解，无残留等特点，且不易产生耐药性，与其他杀虫药无交叉抗性。在土壤降解快、光解迅速。对作物安全，不易产生药害。目前影响其发展的主要原因为作为菌种的阿佛曼链霉菌发酵效价提升缓慢，甚至长期得不到突破性进展。 天然阿维菌素中含有8个组分，主要有4种即Ala、 A2a、 Bla和B2a，其总含量》80% ;对应的4个比例较小的同系物是Alb、A2b、Blb和B2b，其总含量《20%。目前市售阿维菌素农药是以abamectin为主要杀虫成分(AvermectinBla+Blb，其中Bla不低于90%、Blb不超过5% )，以Bla的含量来标定。 AVMBla分子式C48H72014 (R = C2H5) AVMBla分子量872 阿维菌素为白色或淡黄色结晶物，熔点为157_162°C ， a (CHC13) = +55. 7在237、245、254nm处均有吸收峰，A max = 244±2nm，阿维菌素溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、三氯甲烷、乙醇等溶剂，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度极低(10i!g/l)，本品应在干燥、密闭、阴凉遮光下保存。分子中无酸性或碱性官能团，在一般条件下稳定，在ra5-9时不会水解，无腐蚀性，对环境安全。 阿佛曼链霉菌菌种的选育时，经紫外线和亚硝基胍反复处理，菌种的发酵效价得到了显著的提高，从野生菌种发酵效价的10微克/毫升提高到了目前的4000微克/毫升，但是再提高已经非常困难，严重影响了生产规模，生产成本居高不下。业内人士目前面临的主要问题是寻求一种能提高菌种选育技术水平的好方法，以便得到一种对阿维菌素深层培养的高产优质菌种和达到大幅度降低生产成本的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一种正突变变率高，发酵效价高、诱变条件可控可调可多次重复的。 菌种的中能重离子束辐照诱变是一种新近发现的独特的物理诱变方法，因为重离子束具有参数多样，LET大，RBE高等特性，利用它可提高突变率，拓宽突变谱，縮短育种周期，是近年来辐射育种的一种新方法。 实现上述专利技术目的的技术方案为阿佛曼链霉素菌种用12C+6重离子束辐照进行诱变，辐照剂量范围为40-70Gy，优选剂量为50Gy。 的具体步骤 (1)阿佛曼链霉素菌种孢子悬液用12C+6重离子束辐照进行诱变； (2)将辐照诱变后的孢子悬液和出发菌种的孢子悬液分别进行梯度稀释，用生理盐水稀释至10—4_10—5倍； (3)将稀释的悬液准确转到分离平板培养基上，涂抹均匀，分离单个菌落，测定最佳正突变率最佳诱变剂量； (4)对突变明显的菌落，用接种环取菌落孢子接种在斜面培养基上； (5)将(3)的平板培养基与(4)的斜面培养基包扎后置于28t:恒温箱中培养6天，再置于2-4t:冰箱中等待菌种接种； (6)对比辐照诱变菌种与出发菌种的平板培养结果和斜面培养结果，得出最佳正突变率、最佳诱变剂量，测出致死率和菌落态，得到高效价菌种。 斜面培养基及分离平板培养基配方可溶性淀粉7g、葡萄糖5g、氯化钠0. 5g、硫酸铵2g、硫酸镁lg、磷酸氢二钾3g、轻质碳酸钙3g、琼脂粉20g。 斜面培养基及分离平板培养基的制备方法如下 (1)准确称量可溶性淀粉、葡萄糖、氯化钠、硫酸铵、硫酸镁、磷酸氢二钾依次加入烧杯中，搅拌均匀后调节ra值至7. 50 ; (2)加入琼脂粉搅拌均匀，加热煮沸，待琼脂充分溶解，加入轻质碳酸钙搅拌均匀，定溶质1000ml，再煮沸，趁热分别分装在试管中和三角瓶中； (3)加棉塞包扎试管和三角瓶后，进行120_123°C，22分钟的高压灭菌； (4)斜面培养基的制备灭菌结束后，待培养基温度降至50-6(TC培养基在试管中制备成斜面，待琼脂凝固后，置37t:的恒温箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存等待菌种接种； 分离平板培养基的制备待三角瓶中的分离培养基温度降至50-6(TC时，趁热在平皿上制备平板培养基，待琼脂凝固后包扎，置37t:的恒温箱中空培6-7天，置入2-4t:冰箱保存，等待菌种接种。 本技术方案的实验情况如下 1实验材料和仪器 1. 1出发菌种 阿佛曼菌种系列的除虫链霉菌S. avermitilis ZJAV-A1。 1. 2仪器及试剂4 1. 2. 1 HIFRL型中能重离子加速器，中科院兰州近代物理研究所提供。 1. 2. 2美国瓦里安Prostar 210型高效液相色谱仪，瓦里安Prostar 325型紫外_可见检测器 1.2. 3超净工作台 1. 2. 4旋转摇瓶机，型号X-X 1. 2. 5离心机Anke TDL8 1.2.6隔水式电热恒温培养箱WGP-600 1. 2. 7pH计pHS-3C型，上海雷磁仪器厂 1. 2. 8电子精密天平FA2004 Electronic Balance Accuracy :0. lmg 1. 2. 9生物显微镜CX21BIM 1. 2. 10高压蒸汽灭菌器 1. 2. 11SB超声波清洗器上海Branson公司 1.2.12生理盐水，无水甲醇(分析纯)，无水甲醇(HPLC纯)，双蒸馏水。 2.实验步骤及方法 2. 1菌种的活化 取已知效价且生产性能优良的除虫链霉菌S.avermitilis ZJAV-A1菌种一支，放 置在恒温缓冲间(28 °C 士0.6t:，30min)，使其活化。 2. 212C+6离子束穿透诱变 对出发菌株S. avermitilis ZJAV-A1分批设计多点的不同辐照剂量，以重离子加 速器提供的12C+6离子束对阿维菌素菌种孢子悬浮液二个样品进行第一次辐照诱变，对突 变菌株进行筛选、检测，掌握辐照剂量与正突变菌株产生之间的规律和趋势。在第一次的 基础上，调整剂量再进行第二次辐照诱变。处理4次，然后将处理过的孢子悬液梯度稀释， 准确吸取一个样品的孢子悬液O. 2ml/板，倒在制好的分离平板培养基上，分离单个菌落， 以追求最佳正突变率及最佳诱变剂量。同时，以出发菌种另一个样品孢子悬液同法以普通 分离平板培养基分离对照，以便进行菌落本文档来自技高网...

【技术保护点】
阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为　　（１）阿佛曼链霉素菌种孢子悬液用１２Ｃ＋６重离子束辐照进行诱变，辐照剂量范围为４０－７０Ｇｙ；　　（２）将辐照诱变后的孢子悬液和出发菌种的孢子悬液分别进行梯度稀释，用生理盐水稀释至１０↑［－４］－１０↑［－５］；　　（３）将稀释的悬液准确转到分离平板培养基上，涂抹均匀，分离单个菌落，测定最佳正突变率最佳诱变剂量；　　（４）对突变明显的菌落，用接种环取菌落孢子接种在斜面培养基上；　　（５）将（３）的平板培养基与（４）的斜面培养基包扎后置于２８℃恒温箱中培养６天，再置于２－４℃冰箱中等待菌种接种；　　（６）对比辐照诱变菌种与出发菌种的平板培养结果和斜面培养结果，得出最佳正突变率、最佳诱变剂量，测出致死率、观察菌落形态，得到正突变的菌株。

【技术特征摘要】
阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为(1)阿佛曼链霉素菌种孢子悬液用12C+6重离子束辐照进行诱变，辐照剂量范围为40-70Gy；(2)将辐照诱变后的孢子悬液和出发菌种的孢子悬液分别进行梯度稀释，用生理盐水稀释至10-4-10-5；(3)将稀释的悬液准确转到分离平板培养基上，涂抹均匀，分离单个菌落，测定最佳正突变率最佳诱变剂量；(4)对突变明显的菌落，用接种环取菌落孢子接种在斜面培养基上；(5)将(3)的平板培养基与(4)的斜面培养基包扎后置于28℃恒温箱中培养6天，再置于2-4℃冰箱中等待菌种接种；(6)对比辐照诱变菌种与出发菌种的平板培养结果和斜面培养结果，得出最佳正突变率、最佳诱变剂量，测出致死率、观察菌落形态，得到正突变的菌株。2. 根据权利要求1所述的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为12C+6重离子束辐照进行诱变的剂量为50Gy。3. 根据权利要求1或2所述的阿佛曼链霉菌种的重离子辐照诱变及辐照菌种的培养方法，其特征为斜面培养基及分离平板培养基配方可溶性淀粉7g、葡萄糖5...

【专利技术属性】
技术研发人员：李文建，王曙阳，陈积红，刘敬，颉红梅，
申请(专利权)人：中国科学院近代物理研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]