本发明专利技术一种碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶，一种碱性蛋白酶高产菌株，其特征在于：名称为H-7，分类命名为嗜碱芽孢杆菌（Bacillusalcalophilus），保藏编号为：CGMCC?No.6537，由碱性蛋白酶高产菌株发酵得到。本发明专利技术中诱变获得的产碱性蛋白酶菌株是由嗜碱芽孢杆菌经过低能N+离子注入诱变而得的碱性蛋白酶高产菌株，有效地提高了菌株的产酶能力，其碱性蛋白酶的摇瓶活力最大值到33560U/mL，较出发菌株提高了44.7%，7L规模发酵罐酶活力达到36700U/mL；30L规模发酵罐酶活力达到39600U/mL；200L规模发酵罐酶活力达到40700U/mL。
【技术实现步骤摘要】
碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶
本专利技术属于生物工程，涉及菌种诱变，尤其涉及一种碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶。
技术介绍
碱性蛋白酶(Alkaline Protease)属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性条件下水解蛋白质肽键，其最适作用PH—般为9 11，主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。该酶种最早在猪的胰脏中发现。1913年，Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用。1945年,瑞士的Dr. Jaag等发现了微生物碱性蛋白酶,使蛋白酶有可能广泛应用于洗涤剂工业。1963年，诺和诺德公司(现诺维信公司)发现了更适用于洗涤剂的碱性蛋白酶 Alcalase，酶制剂被广泛地应用于洗涤剂产品中，出现了加酶洗衣粉，随后的20年中，细菌类蛋白酶是唯一被应用于洗涤剂的商品化酶制剂。目前，在世界范围内蛋白分解酶是工业酶中用得最多的一种酶，约占酶总量的60%，其中碱性蛋白酶就占25%。它在商业中的巨大应用前景及在基础研究中的重要作用，吸引着国际国内的许多公司及研究单位竞相对其进行多方面的研究。近年来，离子束作为一种新的诱变源在诱变育种方面因其独特的诱变机理和生物学效应而发展极为迅速，与传统诱变源相比，离子注入除了具有能量沉积效应外，还具有动量传递、质量沉积及电荷中和与交换等效应，它将物理诱变与化学诱变特性于一身，能够在低剂量注入的情况下，显著提高生物的变异率，获得损伤轻、突变率高、突变谱广、遗传稳定的诱变效果。离子注入技术被广泛应用于微生物优良菌株的选育和改良研究中，已选育出一些在工业上具有较大应用前景的生物新品种，并取得了显著的经济效益和社会效益。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用低能N+离子注入技术诱变选育得到的碱性蛋白酶高产菌株及其所产的碱性蛋白酶，本方法有效提高嗜碱芽孢杆菌产碱性蛋白酶的能力。本专利技术实现目的的技术方案如下一种碱性蛋白酶高产菌株，名称为H-7，分类命名为嗜碱芽孢杆菌 (Bacillusalcalophilus)，保藏编号为=CGMCC No. 6537，保藏日期:2012 年 9 月 7 日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号。一种碱性蛋白酶，由权利要求I所述的碱性蛋白酶高产菌株发酵得到。而且,所述碱性蛋白酶的最适作用pH为10. 5,最适作用温度为40°C。而且，所述碱性蛋白酶在pH7 12的范围内稳定，在4(T50°C热稳定性好。 碱性蛋白酶作为洗涤剂添加剂的应用。碱性蛋白酶在皮革行业的应用。碱性蛋白酶在食品行业的应用。本专利技术的优点及积极效果是1、本专利技术中诱变获得的产碱性蛋白酶菌株是由嗜碱芽孢杆菌经过低能N+离子注入诱变而得的碱性蛋白酶高产菌株，有效地提高了菌株的产酶能力，其碱性蛋白酶的活力最大值到33560U/mL，较出发菌株提高了 44. 7%，7L规模发酵罐酶活力达到36700U/mL ；30L 规模发酵罐酶活力达到39600U/mL ;200L规模发酵罐酶活力达到40700U/mL，可降低生产成本，获得良好的经济效益。2、本专利技术中，由筛选的菌株发酵获得的碱性蛋白酶的最适作用pH为10. 5，最适作用温度为40°C，大大提高了酶的最适pH，增加了酶的使用范围。3、本专利技术的碱性蛋白酶在pH7 12、40 °C保温lh，残余酶活为86%以上；在 40^500C、ρΗΙΟ. 5保温lh，残余酶活在74%以上，具有良好的pH稳定性和热稳定性。附图说明图1为本专利技术N+离子注入对菌株存活率的影响曲线；图2为本专利技术N+离子注入对菌株突变及正突变率的影响；图3为本专利技术经低能N+离子注入技术得到的碱性蛋白酶高产菌株H-7的摇瓶发酵产酶曲线图4为本专利技术碱性蛋白酶高产菌株H-7的7L发酵罐发酵产酶曲线；图5为本专利技术碱性蛋白酶高产菌株H-7的30L发酵罐发酵产酶曲线；图6为本专利技术碱性蛋白酶高产菌株H-7的200L发酵罐发酵产酶曲线；图7为本专利技术碱性蛋白酶电泳图；(A. Marker，B.纯化后碱性蛋白酶蛋白，C.发酵液)；图8为本专利技术碱性蛋白酶在口册、6、7、8、9、10、11、12、13下的相对酶活；图9为本专利技术碱性蛋白酶在pH5、6、7、8、9、10、ll、12、13下40°C保温Ih后的残余酶活；图10为本专利技术碱性蛋白酶在30、40、50、60、70、80、90°C下的相对酶活；图11为本专利技术碱性蛋白酶在ρΗΙΟ. 5下、40、50、60°C分别保温2h，每隔20min取样，测定其残余酶活。具体实施方式下面通过具体实施例对本专利技术作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本专利技术的保护范围。I、出发菌株的筛分从斜面(由本实验室筛选获得)上挑取一环新培养的嗜碱芽孢杆菌接入种子培养液中，于34°C、200r/min培养12h，然后涂布到固体培养基中，在34°C的培养箱中继续培养48h，从中挑取20个单菌落转接入斜面，再将这20个斜面菌株接到种子培养基中，每瓶 (50mL种子培养基/250mL三角瓶)接种一个单菌落，200r/min，34°C培养12h，观察菌液变浑浊、无异味后按2% (v/v)接种量转接至液体发酵培养基。34°C，200r/min，挡板三角瓶 (50mL发酵培养基/250mL挡板三角瓶)中振荡培养54h，将发酵液离心后，以福林酚法测定4粗酶液活力，结果如表I所示。测定碱性蛋白酶活力后，选择酶活较高且较稳定的菌株作为出发菌株。原始出发菌株经过复壮后，菌种发酵液的酶活平均值为19000U/mL 23000U/mL。YH-16最高，为 23200U/mL。将上述试验中酶活较高的菌株YH-16进行传代试验，连续传代20次考察菌株遗传性状的稳定性。其结果为(见表2):此菌株高产且稳定性好，适合作为离子注入诱变的出发菌株。2、N+离子注入诱变⑴样品的前处理将嗜碱芽孢杆菌出发菌株于产芽孢培养基中培养至产芽孢期， 取O. ImL芽孢悬液均匀地涂布于无菌平板上，用无菌风吹干后，然后将平板放入低能加速器靶室，靶室抽真空，用能量为30keV的不同剂量的、N+离子束进行注入。⑵离子注入条件注入能量为30keV，靶室真空度为5_6 X 10_3Kpa，以6s脉冲式注入，间隔为60s，单次注入剂量为I X 1014N+ions/cm2 ;注入剂量分别为5、10、15、20、30、50、 70、100、200。每个注入剂量做一个真空对照。每个处理及其相应的真空对照在离子注入前预抽真空5min，以消除因真空干燥程度不同可能带来的影响；⑶样品的后处理将经过N+离子注入的培养皿和真空对照的培养皿分别用无菌水洗脱，适当稀释后涂布于活化平板上，置34°C下培养48h后计数，用于单菌落的计数和存活率的挑选。存活率为经N+离子注入处理的存活菌落数与经真空对照处理的存活菌落数的比值。⑷存活率曲线的绘制吸取离子注入后的孢子悬液lmL，注入装有9mL无菌水的试管中，制成ICT1稀释液；反复吹吸ICT1的稀释液，使其混合均匀后吸取lmL，注入装有9mL无菌水的试管中，制成10_2稀释液；按上述程序操作，制备10_3稀释液；选择适宜浓度的稀释液，分别取O. ImL涂布于平皿中，每本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种碱性蛋白酶高产菌株，其特征在于：名称为H？7，分类命名为嗜碱芽孢杆菌（Bacillus？alcalophilus），保藏编号为：CGMCC？No.6537，保藏日期：2012年9月7日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，刘逸寒，刘敏尧，刘靓，樊帅，王春霞，王建玲，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。