本发明专利技术公开了一株产L-苯丙氨酸的菌株及其应用。本发明专利技术公开的一株重组大肠杆菌MD1078（Escherichia coli MD1078），其保藏编号为CCTCC NO:M2013509。该菌株在100L全自动发酵罐中，36℃、溶氧35%-50%，发酵时间为48小时的条件下，L-苯丙氨酸产量达到86.5g/L。大肠杆菌MD1078产L-苯丙氨酸的能力高，在L-苯丙氨酸的实际生产中具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株产L-苯丙氨酸的菌株及其应用。
技术介绍
L-苯丙氨酸（L-phenylalanine)为白色结晶粉末，是人体和动物不能在体内自行 合成的必须氨基酸之一，广泛应用于食品、饲料、医药和化妆品等领域。L-苯丙氨酸作为合 成阿斯巴甜（Aspartame)的两种原料之一，在制备低热量、高甜度的二肽甜味剂阿斯巴甜中 的应用日益广泛，L-苯丙氨酸的市场需求量迅速增加。另外L-苯丙氨酸也是抗肿瘤药物 和氨基酸输液制剂的必需原料，随着其在医药领域的不断开发，需求量也不断增加。因此， 对L-苯丙氨酸生物合成途径的研究、L-苯丙氨酸产生菌的改良和对其工业化生产的研究 越来越受到人们的重视。 国内外L-苯丙氨酸的生产方法主要有水解抽提法、化学合成法、酶法和发酵法 等。由于天然蛋白中L-苯丙氨酸含量较低，水解抽提法很少使用；化学合成法的工艺复杂， 成本较高，在国外基本上被酶法和发酵法取代。但由于底物和酶的价格较高且来源有限， 酶法应用也受到限制；由于微生物直接发酵法可利用廉价易得的原料，又可在常温常压下 进行，是目前国内外生产L-苯丙氨酸的主流方法，具有较大的竞争优势。但是由于L-苯 丙氨酸等终产物对野生菌株体内的芳香族氨基酸合成代谢途径上的关键酶有着强烈的反 馈抑制作用，使其细胞不能大量蓄积苯丙氨酸，因此若要进行实际发酵生产，就亟需获得产 L-苯丙氨酸能力高的菌株。 所谓的易错PCR技术是指在体外扩增目的基因时，利用Taq酶的低保真度，同时调 整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变dNTP的比例浓度等方法，以一定的频率 向目的基因随机引入碱基错配，导致目的基因的随机突变构成突变库，然后选择或者筛选 出需要的突变体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株产L-苯丙氨酸的菌株及其应用。 本专利技术提供的一株重组大肠杆菌MD1078(EscherichiacoliMD1078)，其保藏编 号为CCTCCNO:M2013509。 保藏编号为CCTCCN0:M2013509的大肠杆菌在生产L-苯丙氨酸中的应用也属于 本专利技术的保护范围。 -种生产L-苯丙氨酸的方法也属于本专利技术的保护范围，该方法包括如下步骤：将 保藏编号为CCTCCN0:M2013509的大肠杆菌发酵培养，得到L-苯丙氨酸。 上述方法中，所述发酵培养中使用的发酵培养基每100ml的组成如下： 葡萄糖2g，硫酸铵2g，柠檬酸钠0. 05g，硫酸镁0. 08g，磷酸二氢钾0.lg，磷酸氢二 钾0?lg，酵母粉0?lg，谷氨酸钠0? 05g，MnCl20. 2mg，尼克酸lmg，C〇C120.Olmg，ZnS040.lmg， CaCl20. 5mg，VB1lmg，MnCl20. 2mg，酪氨酸3mg，余量为水。 上述任一所述的方法中，所述发酵的条件为36°C、溶氧35%-50%，当发酵体系中的 葡萄糖含量低于15g/L时开始添加葡萄糖，使葡萄糖的含量保持在10g/L-15g/L之间。 上述任一所述的方法中，所述发酵的时间为48小时。 上述任一所述的方法中，所述菌株是通过种子液接入发酵培养基的。 上述任一所述的方法中，所述种子液的制备培养基每100ml的组成如下：葡萄糖 3g，硫酸铵lg，硫酸镁0. 08g，磷酸二氢钾0.lg，磷酸氢二钾0.lg，酵母粉0. 2g，谷氨酸钠 0? 08g，MnCl20. 25mg，C〇C120. 005mg，ZnS040. 15mg，CaCl20. 5mg，VB1lmg，MnCl20. 2mg，酿氛酸 3mg，余量为水。 上述任一所述的方法中，所述种子液制备时的培养条件为36°C、溶氧为40%-60%， 葡萄糖的含量为30g/L。 上述任一所述的方法中，所述种子液的培养时间为12小时。 实验证明，利用本专利技术提供的保藏编号为CCTCCN0:M2013509的大肠杆菌生产 L-苯丙氨酸，L-苯丙氨酸的产量可达86. 5g/L，证明本专利技术菌株产L-苯丙氨酸的能力很高， 在L-苯丙氨酸的实际生产中具有广阔的应用前景。【附图说明】图 1 为pBV22〇-aroG-pheA质粒。 图2为氨基酸标准溶液的HPLC谱图。 图3为大肠杆菌MD1078发酵液上清的稀释液的HPLC谱图。 图4大肠杆菌10245发酵液上清的稀释液的HPLC谱图。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。PMD-18T购自宝生物工程(大连）有限公司，产品目录号为D101A。PBV220购自北京鼎国生物科技有限公司。 大肠杆菌（Escherichiacoli)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心（www. china_cicc.org)，保藏编号为10245,简称大肠杆菌10245。发酵培养基：50g/L葡萄糖、10g/L酵母膏、3g/LNa2HP04、lg/LKH2P04、12g/L NH4Cl、lg/LMgS04、0. 3g/LCaCl2、6g/L柠檬酸钠、0? 6g/L谷氨酸钠、2g/L蛋白胨、20mg/LVB1， 余量为水。L-苯丙氨酸购自北京盈泽纳新化工技术研究院，产品号为GF2212。 每100ml发酵罐种子培养基按照如下方法配制： 葡萄糖3g，硫酸铵lg，硫酸镁0. 08g，磷酸二氢钾0.lg，磷酸氢二钾0.lg，酵母 粉 0? 2g，谷氨酸钠 0? 08g，MnCl20. 25mg，C〇C120. 005mg，ZnS040. 15mg，CaCl20. 5mg，VB1lmg， MnCl20. 2mg，酪氨酸3mg，加水定容至100ml，灭菌。 每l〇〇ml发酵罐发酵培养基按照如下方法配制： 葡萄糖2g，硫酸铵2g，柠檬酸钠0. 05g，硫酸镁0. 08g，磷酸二氢钾0.lg，磷酸氢二 钾 0?lg，酵母粉 0?lg，谷氨酸钠 0? 05g，MnCl20. 2mg，尼克酸lmg，C〇C120.Olmg，ZnS040.lmg， CaCl20. 5mg，VB1lmg，MnCl20. 2mg，酪氨酸3mg，加水定容至100ml，灭菌。 氨基酸标准溶液购自天津博纳艾杰尔科技有限公司。实施例1、生产L-苯丙氨酸的菌株的制备 一、重组质粒pBV220-aroG_pheA的构建 提取大肠杆菌10245的基因组DNA，以其为模板，用引物ar〇G-f和ar〇G-r为引物， 进行PCR扩增，得到aroG基因。 提取大肠杆菌10245的基因组DNA，以其为模板，用引物pheA-f和pheA-r为引物， 进行PCR扩增，得到pheA基因。EcoRI和KpnI双酶切aroG基因，得到基因片段；EcoRI和KpnI双酶切 PMD-18T，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为 pMD-18T_aroG。KpnI和BamHI双酶切pheA基因，得到基因片段；KpnI和BamHI双酶切 PMD-18T，得到载体大片段；将基因片段与载体大片段连接，得到重组质粒，将其命名为 pMD_18T_pheA。aroG-f: 5，-CGGAATTCATGAATTATCAGAACGACGAT-3，aroG-r: 5，-GGGGTACCACCCGCGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株重组大肠杆菌MD1078（Escherichia coli MD1078），其保藏编号为CCTCC NO:M 2013509。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：施巧琴，吴伟斌，翁雪清，黄钦耿，赵燕玉，陈炳生，吴松刚，
申请(专利权)人：福建省麦丹生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：福建;35
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