生产红霉素的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了生产红霉素的工程菌及其应用。本发明专利技术保护将重组质粒导入红色糖多孢菌得到的重组菌；所述重组质粒为将ermE*启动子、eryBII蛋白的编码基因和eryF蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒中由ermE*启动子启动所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因的表达；所述红色糖多孢菌的ATCC编号为11635。本发明专利技术的提供的工程菌可直接发酵得到红霉素，发酵液中的红霉素效价可达8000U/ml，生产成本低，是一种具有生产应用价值的生产菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生产红霉素的工程菌及其应用。
技术介绍
红霉素是一类大环内酯类抗生素，广泛应用于抑制革兰氏阳性菌的感染。自1952 年发现以来，红霉素及其衍生物在临床上得到了广泛的应用。目前红霉素类抗生素年销售额超过35亿美元，位居抗生素销售额第三位，被认为是下一代治疗耐药性细菌的抗生素， 随第二代红霉素(如阿奇霉素、罗红霉素、克拉霉素等)、第三代红霉素(如泰利霉素)在日本和欧洲上市，国内外市场对红霉素的需求大大增加。目前我国是世界最大的红霉素原料生产国，但是主要还是依靠发酵生产，普遍存在红霉素效价低的问题。国内提高红霉素发酵效价主要是通过传统的育种工作，如使用有效的化学或放射线随机诱导菌种突变以提高菌株的抗生素产量，或者使用天然杂交或原牛质体融合技术从突变筛选系的分支处组合预期基因以得到高产量的菌株。传统的育种方法存在一些局限性，如目标性差，筛选工作繁重，周期长等。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供生产红霉素的工程菌及其应用。本专利技术保护将重组质粒导入红色糖多孢菌得到的重组菌；所述重组质粒为将 ermE*启动子、eryBII蛋白的编码基因和eryF蛋白的编码基因插入出发载体的多克隆位点得到的重组质粒；所述重组质粒中由ermE*启动子启动所述eryBII蛋白的编码基因和所述 eryF蛋白的编码基因的表达；所述红色糖多孢菌的ATCC编号为11635 ;所述ermE*启动子如序列表的序列I所不；所述eryBII蛋白如序列表的序列2所不；所述eryF蛋白如序列表的序列4所示。所述eryBII蛋白的编码基因可如序列表的序列3所不；所述eryF蛋白的编码基因可如序列表的序列5所示。所述重组质粒中，自上游至下游可依次包括所述ermE*启动子、所述eryBII蛋白的编码基因和所述eryF蛋白的编码基因。所述出发载体具体可为载体PSET152。所述重组质粒具体可为将所述ermE*启动子插入所述载体pSET152的XbaI酶切位点、所述eryBII蛋白的编码基因插入所述载体pSET152的BamHI和EcoRI酶切位点之间、 所述eryF蛋白的编码基因插入所述载体pSET152的EcoRI酶切位点得到的重组质粒。所述重组菌具体可为红色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSEOO15。 红色糖多抱菌(Saccharopolyspora erythraea)MFSEOO15简称红色糖多抱菌MFSE0015,已于2012年3月2日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC ;地址中国武汉，武汉大学；邮编:430072)，保藏编号为 CCTCC NO M 2012052。以上任一所述重组菌均可用于生产红霉素。本专利技术还保护一种生产红霉素的方法，包括如下步骤将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到红霉素。所述发酵的条件可为33. 5°C、振荡培养6天。所述发酵采用的发酵培养基具体如下由溶质和水组成；每50!111发酵培养基含如下溶质35g玉米淀粉、30g黄豆饼粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸铵、12ml豆油和6g碳酸钙。所述发酵培养基的pH具体可为7。所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比具体可为I : 10。所述培养的条件可为33. 5°C、振荡培养2天。所述种子培养基由溶质和水组成；每50ml种子培养基含如下溶质50g玉米淀粉、15g黄豆饼粉、12ml玉米楽；、1. 5g氯化钠、I. 5g硫酸铵、7ml豆油和6g碳酸钙。所述种子培养基的pH具体可为7。以上任一所述重组菌均可用于生产微生物抑制剂。所述微生物可为短小芽孢杆菌，具体可为CMCC编号为63202的短小芽孢杆菌。本专利技术还保护一种生产微生物抑制剂的方法，包括如下步骤将以上任一所述的重组菌进行发酵，得到微生物抑制剂。所述发酵的条件可为33. 5°C、振荡培养6天。所述发酵采用的发酵培养基具体如下由溶质和水组成；每50!111发酵培养基含如下溶质35g玉米淀粉、30g黄豆饼粉、30g糊精、0.6ml正丙醇、2g硫酸铵、12ml豆油和6g碳酸钙。所述发酵培养基的pH具体可为7。所述重组菌具体可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。所述种子液是将所述重组菌接种至种子培养基进行培养得到的。每100毫升所述种子液中含有10-15g湿重的菌体。所述种子液与所述发酵培养基的体积配比具体可为I : 10。所述培养的条件可为33. 5°C、振荡培养2天。所述种子培养基由溶质和水组成；每50ml种子培养基含如下溶质50g玉米淀粉、15g黄豆饼粉、12ml玉米楽；、1. 5g氯化钠、I. 5g硫酸铵、7ml豆油和6g碳酸钙。所述种子培养基的PH具体可为7。所述微生物可为短小芽孢杆菌，具体可为CMCC编号为63202的短小芽孢杆菌。本专利技术运用代谢工程的手段对红霉素产生菌进行分子改造，在强启动子ErmE*作用下增加红霉素代谢途径中关键酶eryBII基因及eryF基因的拷贝数，从而提高红霉素效价。本专利技术提供的工程菌可直接发酵得到红霉素，发酵液中的红霉素效价可达8000U/ml，生产成本低，是一种具有生产应用价值的生产菌株。附图说明图I为载体pSET152的结构示意图。图2为重组质粒pSET152 — ermE*的结构示意图。图3为重组质粒pSET152 — ermE*_eryBII的结构示意图。图4为重组质粒pSET152-ermE*-eryBII_eryF的结构不意图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea),又称糖多孢红霉菌,获自美国模式培养物集存库01 :// 冊.&丨(^.0找/，简称4了0)，编号为11635，简称红色糖多孢菌 11635，是一类放线菌类微生物。短小芽孢杆菌购自国家微生物菌种资源库(简称CMCC,网址为http://matrs. com/)，编号为63202，简称短小芽孢杆菌63202。红霉素(标准品)购自国家标准物质信息库，C13203490-红霉素标准品。实施例I、重组质粒 pSET152-ermE*-eryBII_eryF 的构建一、重组质粒pSET152_ermE*的构建I、合成序列表的序列I所示的双链DNA分子(序列I中，自5’末端第10至225 位核苷酸为红酶素启动子ermE*，第4至9位核苷酸为XbaI酶切识别序列，第226至231位核苷酸为XbaI酶切识别序列)。2、用限制性内切酶XbaI酶切步骤I合成的双链DNA分子，回收酶切产物。3、用限制性内切酶XbaI酶切载体pSET152 (长沙赢润生物技术有限公司，结构示意图见图1，大肠杆菌和链霉菌的穿梭质粒)，回收载体骨架(约5700bp)。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pSET152_ermE*。 重组质粒pSET152-ermE*的结构示意图见本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴伟斌，黄钦耿，施巧琴，翁雪清，赵燕玉，黄祥峰，黄维锦，吴松刚，
申请(专利权)人：福建省麦丹生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：