一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用，本发明专利技术的生产脂肪酶和酯酶的菌株为寡养单胞菌，保藏编号为CGMCC NO.10672。本发明专利技术提供了一株高效利用雨生红藻油和/或水生动物(如虾及蟹)有机溶剂提取物生产游离虾青素的寡养单胞菌菌株，该菌株能够高效的降解虾青素酯制备游离虾青素。而且，本发明专利技术通过实验，确定发酵液中吐温80添加量、接种量、发酵液初始pH、发酵时间条件，从而提供了一种高效的制备游离虾青素的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于功能微生物筛选
，具体涉及一种虾青素酯酶生产菌株及其在 游离虾青素制备中的应用。
技术介绍
虾青素（Astaxanthin，又称3, 3' -二羟基-4, 4' -二酮基-β，β -胡萝卜素）是 萜烯类不饱和化合物，是类胡萝卜素的一种，广泛存在于生物体内，特别是虾、蟹、藻类和鱼 类等水生生物。虾青素为紫红色，易氧化，氧化后为虾红素（Astacene)。虾青素不溶于水， 具有脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳。 大量研宄发现，虾青素具有良好的生物学功能，如抗衰老、抗氧化、增强机体免疫 力、抗肿瘤等。虾青素独特的分子结构，使其成为自然界最强的抗氧化剂，其抗氧化能力是 其他类胡萝卜素的10倍，维生素 E的500倍，被誉为"超级抗氧化剂"或"超级维生素 Ε"。 目前，虾青素已凭借其良好的生物学功能，成为众多行业的"宠儿"，比如食品、水产养殖、医 药及化妆品等行业。 目前，虾青素的生产主要分为两类，一类是化学合成法，另一类是生物法。与生物 法相比，化学合成法不仅工艺过程繁琐复杂，而且合成过程中可能被其它有害物质污染，产 品中还含有非天然的异构体，影响其安全性。不仅如此，化学合成的虾青素在结构、生理功 能、应用等方面与天然虾青素有着很大的区别，使得化学合成虾青素的应用受到进一步的 限制。在结构方面，化学合成的虾青素主要为顺式结构，而天然虾青素主要为反式结构。目 前，世界各国越来越重视对化学合成虾青素的管理，其中美国食品与药物管理局（FDA)已 明确禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场，仅允许反式结构的虾青素作为水产养殖的 添加剂。因此，生物法将取代化学合成法，成为生产虾青素的主要方法。 在生物法制备过程中，主要是从水生动物（如虾及蟹）的壳内以及培养的雨生红 球藻中提取虾青素。水生动物和雨生红球藻中的虾青素多以虾青素酯的形式存在，通过将 虾青素酯水解可获得游离虾青素。目前水解虾青素酯主要采用皂化的方法，该方法虽然具 有反应迅速的优点，但反应过程过于剧烈，难以对产物进行控制，高浓度的碱也会对虾青素 造成破坏，产生较多的副产物，如产生虾红素和半虾红素等。不仅如此，反应过程采用大量 的碱和有机溶剂，不仅破坏了环境，而且造成了极大的浪费，不符合国家发展的战略。另外 一种是采用脂肪酶酶解的方法，通过使用脂肪酶降解虾青素酯来制备游离虾青素，这为游 离虾青素的生产提供了一条新的思路，但酶解过程复杂，需预先水解甘油三酯，并移除游离 脂肪酸后，再利用脂肪酶水解虾青素酯，耗时长、成本高。而且由于虾青素酯的水不溶性和 成分复杂等特点，导致脂肪酶酶解效率较低，使其在大规模制备过程中会受到限制。利用发 酵法制备游离虾青素被认为是一个有效的方法，但目前存在的混菌发酵法并不能实现虾青 素酯的完全水解，游离虾青素生产的工业化进程依旧无法实现。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供， 即一种能高效降解虾青素酯的菌株，及该菌株在生产游离虾青素中的应用，从而弥补现有 技术的不足。 本专利技术首先提供一种寡养单胞菌（Stenotrophomonas sp. )OUC-LH15,该菌株于 2015年03月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研宄 所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，保藏编号为 CGMCC NO. 10672。 上述的寡养单胞菌用于发酵生产游离虾青素； 本专利技术还提供一种生产游离虾青素的方法，是在添加有虾青素酯或提供虾青素酯 的原料的培养基中接种寡养单胞菌来发酵制备游离虾青素。 作为优选，所述的含有虾青素酯的原料为雨生红球藻油和/或含有虾青素酯的水 生动物（如虾及蟹）的有机溶剂提取物。 作为优选，发酵培养基的组成如下（g/mL质量体积比）：雨生红球藻油和/或含有 虾青素酯的水生动物（如虾及蟹）有机溶剂提取物、KH 2PO4 0· 025%、MgS04 ·7Η20 0· 025%、 FeSO4 · 7Η20 0· 001%、牛肉膏 0· 1%、蛋白胨 1%、ρΗ 7· 0， 上述的培养基中优选添加 Tween-80,其添加量依据实施过程的发酵优化结果来 定； 本专利技术提供了一株高效利用雨生红藻油和/或水生动物（如虾及蟹）有机溶剂 提取物生产游离虾青素的寡养单胞菌菌株，该菌株能够高效的降解虾青素酯制备游离虾青 素。而且，本专利技术通过实验，确定发酵液中吐温80添加量、接种量、发酵液初始pH、发酵时间 条件，从而提供了一种高效的制备游离虾青素的方法。【附图说明】 图I :Tween-80添加量对发酵的影响图； 图2 :种龄对发酵的影响图； 图3 :接种量对发酵的影响； 图4 :发酵液初始pH对发酵的影响； 图5 :菌株发酵曲线图； 图6 :本专利技术微生物发酵法制备的游离虾青素 HPLC图谱 图7 :皂化法制备的游离虾青素的HPLC图谱 图8 :雨生红球藻油中虾青素酯的HPLC图谱。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术进行详细的描述。 一、降解虾青素酯菌株的筛选 本专利技术所使用的培养基配方如下： 1)富集培养基 NH4NO3 0· 1 %，KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0· 001 %，胆固 醇油酸酯〇. 1%，自来水配，pH 7. 0，115°C灭菌30min。 2)筛选平板固体培养基（固体筛选平板） NH4NO3 0· 1 %，KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0· 001 %，胆固 醇油酸酯（L〇%Triton X-100助溶）0· 1%，琼脂2%，自来水配，pH 7.0，115°C灭菌30min。 3)发酵培养基 雨生红球藻油发酵培养基：KH2PO4 0· 025%，MgSO4 · 7H20 0· 025%，FeSO4 · 7H20 0. 001 %，牛肉膏0.1 %，蛋白胨I %，雨生红球藻油（0. 4% Tween80助溶）0. 5%，自来水配， pH 7. 0,115°C灭菌 30min。 胆固醇油酸酯发酵培养基：KH2PO4 (λ 025%，MgSO4 · 7Η20 (λ 025%，FeSO4 · 7H20 0.001%，牛肉膏 0.1%，蛋白胨 L0%，胆固醇油酸酯 0.1%，Tween 80 0.4%，pH 7.0， 115°C高压灭菌30min。 4)种子培养基 牛肉膏0.3%，蛋白胨l%，NaCl 0.3%，自来水配，pH 7.0，115°C高压灭菌30min。 1、菌株的筛选过程 I. 1富集培养 将配制的富集培养基IOOmL于250mL三角瓶中，灭菌备用。将3g取自屠宰场的土 样加入到三角瓶中，混合均匀后，在37°C 180rpm下培养24h。 I. 2平板初筛 取富集培养的菌液进行100倍的适度稀释，涂布于固体筛选平板上；置于37°C培 养箱中，静置培养48h。 L 3发酵复筛 (1)菌株富集挑选平板初筛得到的阳性菌株于灭菌的种子培养基中，在 37°C 180rpm下富集培养24h。 (2)发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡养单胞菌，其特征在于，所述的寡养单胞菌的保藏编号为CGMCC NO.10672。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛相朝，董浩，薛长湖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37