本发明专利技术公开了一种以海水为介质生产燃料用碳氢化合物的方法及专用菌株。该菌株为盐单胞菌（Halomonas?sp.）LS21，其保藏编号为CGMCC?No.6593。本发明专利技术的实验表明，Halomonas?sp.LS21及其基因重组菌株可以在以天然海水为发酵介质，利用多种廉价碳、氮源-包括经预处理的纤维素、半纤维素、废弃油脂及餐厨垃圾等为底物，生产以主要组成为烷烃、烯烃及长链脂肪酸的碳氢化合物。此类碳氢化合物经分离后可作为生物燃料使用；且发酵过程可以实现不灭菌连续发酵。本发明专利技术中的盐单胞菌及其重组菌株营养要求简单、发酵过程无需灭菌且可连续进行，简单易控、低成本、具有良好的工业应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种以海水为介质生产燃料用碳氢化合物的方法及专用菌株。
技术介绍
几个世纪以来，常规的化石能源一直支撑着工业文明的发展。但是由于化石能源的不可再生性，地球亿万年积存下的宝贵资源在人类高强度开采与消费下最终会消耗殆尽。同时过度使用化石资源所带来的气候变化、环境污染等问题也将使人类付出巨大的代价。能源供应问题将成为制约我国未来社会经济可持续发展的重要因素。为保证能源供应的独立性和可持续性，目前各国掀起了一场能源和化工领域新技术浪潮，即用“细胞工厂与生物合成”逐步替代传统的化工工艺。利用生物技术以可再生生 物资源为原料生产生物燃料和各种化工原料和产品更是其中的热点。与传统的化石燃料相比，生物燃料具有可再生、无毒、可降解的特点，并能有效减少有害气体和颗粒物的排放，是优质的化石燃料替代品，故又称其为“绿色燃料”。但目前上市的生物燃料主要来源于玉米淀粉的发酵反应以及大豆、油菜籽、棕榈油中三酰甘油的体外转酯化反应，其成分为乙醇、脂肪酸甲酯或乙酯等。这种利用粮食作物为原料生产生物燃料的方法已经产生了与人争粮、占用大量的耕地的情况；传统的发酵工艺需要消耗大量的淡水作为介质，反应后产生大量不易处理的废水，既消耗了资源又污染了环境。为了提高生物燃料的实用性和应用范围，着力于开发新的催化方法和工艺流程，寻找更高效的转化酶以及优化酶的使用方法，扩展可利用的原料以及发酵介质范围成为必须。在此基础上，通过改造微生物的代谢途径，使其能利用廉价的非粮油类原料如纤维素等，直接在生物体内生产生物燃料，从而摆脱一系列的高能耗生产过程，降低成本。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一株盐单胞菌(Halomonas sp.)。本专利技术提供的盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS 21，其保藏编号为CGMCC No. 6593。上述的盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS 21在制备聚羟基脂肪酸酯/3-羟基丁酸和/或脂肪酸中的应用也是本专利技术保护的范围；上述应用中，所述脂肪酸具体为C16脂肪酸，也称为棕榈酸。可以利用合成生物学的方法对上述的盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS 21进行基因重组，修饰其代谢通路，使该基因工程菌株在能够利用多种碳、氮源的基础上，表达编码催化生产碳氢化合物的酶的相关基因。因此，本专利技术另一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌，为将酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因均导入宿主菌中，得到重组菌。上述重组菌中,宿主菌为盐单胞菌(Halomonas sp.);本专利技术的实施例中具体采用盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS 21 ；上述酰基酰基载体蛋白还原酶和上述乙醛脱羧酶具体均来自蓝细菌；本专利技术的实施例中蓝细菌具体为集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)或念珠蓝细菌(Nostoc sp.)。上述重组菌中，将酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因均导入宿主菌为将含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段导入宿主菌；所述含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列I或序列表中的序列4。上述重组菌为如下重组菌A或重组菌B 重组菌A为将来自集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段(序列I)导入盐单胞菌(Halomonas sp.)LS 21中；具体本专利技术中导入来自集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段通过重组载体A导入盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS 21中，该重组载体A为将序列表中的序列I插入载体pBBRlMCSl的XbaI和BamH I位点间得到表达酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶。集胞蓝细菌(Synechocystis sp.)中的酰基酰基载体蛋白还原酶的氨基酸序列为序列表中的序列2 ;所述酸基酸基载体蛋白还原酶的基因的核昔酸序列为序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸；乙醛脱羧酶的氨基酸序列为序列表中的序列3 ;所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸。重组菌B为将来自念珠蓝细菌(Nostoc sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段(序列4)导入盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS21中；具体本专利技术中导入来自念珠蓝细菌(Nostoc sp.)的含有酰基酰基载体蛋白还原酶的编码基因和乙醛脱羧酶的编码基因的片段通过重组载体B导入盐单胞菌(Halomonas sp.)LS 21中，该重组载体B为将序列表中的序列4插入载体pBBRlMCSl的XbaI和BamH I位点间得到表达酰基酰基载体蛋白还原酶和乙醛脱羧酶。念珠蓝细菌(Nostoc sp.)中的酰基酰基载体蛋白还原酶的氨基酸序列为序列表中的序列5 ;所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸；乙醛脱羧酶的氨基酸序列为序列表中的序列6 ;所述酰基酰基载体蛋白还原酶的基因的核苷酸序列为序列表中序列4自5’末端第I位-696位核苷酸。上述重组载体还包含可操作地连接到所述核苷酸序列的启动子。所述启动子是具有调节细胞器特异性、组织特异性、诱导型、组成型或细胞特异性表达的启动子。在具体实施方案中，所述重组载体包含具有以下特征的序列(I)可操作地连接到所述核苷酸序列的调节序列；(2)可操作地连接到所述核苷酸序列的选择标记；(3)可操作地连接到所述核苷酸序列的标记序列；(4)可操作地连接到所述核苷酸序列的纯化部分；(5)可操作地连接到所述核苷酸序列的目的基因表达序列。在某些实施方案中，所述核苷酸序列被稳定整合到所述宿主细胞的基因组中，并且该核苷酸序列的表达受可调节启动子的控制。上述的重组菌在制备烷烃中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中，所述烷烃具体为十三烷、十五烷和/或十七烷；本专利技术的第三个目的是提供一种发酵培养基，该发酵培养基可用来培养盐单胞菌(Halomonas sp. ) LS 21 或上述重组菌。本专利技术提供的发酵培养基，由C源、N源和海水组成；所述C源为秸杆纤维素浸提液、油酸、动物脂肪和可溶性淀粉中的至少一种；所述N源为大豆蛋白和乳清蛋白中的至少一种；所述海水为天然海水或人工海水；所述秸杆纤维素浸泡液按照如下方法制备将秸杆在NaOH水溶液浸泡，收集液体即为秸杆纤维素浸泡液。具体按照如下方法制备将秸杆在浓度为lg/L、pH值为14的NaOH水溶液4°C浸泡48h，收集液体即为秸杆纤维素浸泡液；其中秸杆为气爆处理后的秸杆；在本专利技术的实施例中采用气爆处理后的玉米秸杆，具体方法为将含水量10-35%的玉米秸杆在蒸汽压力I. 0-1. 5MPa的条件下进行蒸汽爆破处理O. 5h，烘干得到气爆处理后的秸杆。上述发酵培养基由所述秸杆纤维素浸提液、所述油酸、所述动物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白、所述乳清蛋白和所述海水组成；所述秸杆纤维素浸提液、所述油酸、所述动物脂肪、本文档来自技高网...
【技术保护点】
盐单胞菌（Halomonas？sp.）LS？21，其保藏编号为CGMCC？No.6593。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国强，岳海涛，尹进，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：
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