一种诱变乳酸产生菌生产L-丙氨酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种诱变乳酸产生菌生产L-丙氨酸的方法，属于微生物技术领域，以德氏乳杆菌保加利亚亚种Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus为出发菌种，经过活化出发菌→低能离子注入法诱变处理细胞→可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株→扩增培养种子液→厌氧发酵生产L-丙氨酸→发酵液净化处理→制得成品。有益效果是采用的低能离子注入诱变法突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定；原材料葡萄糖属于可再生纯天然资源，来源广泛，价格低廉，且厌氧发酵减少了动力消耗，降低了生产成本；提纯过程中使用超滤膜过滤和纳滤膜过滤去除杂质，保证了产品质量，适合大规模工业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种诱变乳酸产生菌生产L-丙氨酸的方法，属于微生物

技术介绍
L-丙氨酸是组成蛋白 质的氨基酸之一，虽为人体非必须氨基酸，却是人体血液中含量最高的氨基酸，在医药、高分子材料、食品等领域具有广泛的用途。在医药领域L-丙氨酸作为医药中间体，是生产维生素B6及L-氨基丙醇的主要原料；L-丙氨酸与糖代谢密切相关，在转氨反应中是主要的氨基供体，具有重要的生理功能，在临床上常添加到输液中；另外，L-丙氨酸还是一种很好的利尿药。在高分子材料领域近年来发现将L-丙氨酸添加到聚乳酸中可有效提高聚乳酸的性能。在食品领域L-丙氨酸具有独特的改善风味的效果，与其他氨基酸配合使用能加强食品和饮料的风味；L-丙氨酸的添加可以明显提高食品和饮料中蛋白质的利用率，还可以改善有机酸的酸味，越来越受到人们的欢迎和重视。目前，L-丙氨酸的主要工业化生产方法是酶法转化，即通过富有L-天冬氨酸-P -脱羧酶活力的微生物细胞催化L-天冬氨酸而得到L-丙氨酸。酶法转化工艺的特点是酶活力高，设备投资小，提取工艺简单，但其主要原材料L-天冬氨酸价格较贵，造成其生产成本较高。Pascal Hols等报道了利用基因工程手段改造乳酸菌，以葡萄糖、蔗糖或乳糖等为原料发酵生产L-丙氨酸的方法(US 6 627 420 BI)，但是基因工程方法构建菌种的过程复杂，技术要求高，而且得到的基因工程菌株很难稳定遗传和保藏。高理所等报道了利用紫外线和激光等复合诱变的方法筛选L-丙氨酸的高产菌株(安徽工程科技学院学报，2008，23 (I): 19-24)，但是由于紫外线对各种微生物的诱变效应不同，加上微生物吸收射线剂量的大小很难把握，且突变后易发生光修复作用，所以紫外线诱变的效果不佳，正突变率较低,死亡率较高。离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新方向，是集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法。与传统的诱变源如X射线、Y射线、紫外线以及各种化学诱变剂相比，离子注入法不仅有能量沉积，还有动量传递、质量沉积及电荷交换等效应。低能离子束对微生物的诱变是直接作用和间接作用的共同结果，其直接作用主要是注入离子的动量传递于细胞表面产生的溅射作用和沉积于细胞内部产生的刻蚀损伤，而间接作用主要是注入离子的能量沉积于细胞内部产生的自由基所导致的作用。它能够引起染色体的畸变，导致DNA链碱基的损伤、断裂，从而使遗传物质在基因水平或分子水平上发生改变或缺失，大幅提闻变异的频率。
技术实现思路
针对上述现存的技术问题，本专利技术提供一种诱变乳酸产生菌生产L-丙氨酸的方法，以德氏乳杆菌保加利亚亚种delbrueckii subsp. bulgaricus为货发菌种，采用低能离子注入法诱变处理细胞，并通过可逆抑制测定法筛选出生产L-丙氨酸的突变株，用该突变株以葡萄糖为底物、厌氧条件下发酵生产L-丙氨酸。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现本方法以乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种delbrueckii subsp.■为出发菌种,活化出发菌一低能离子注入法诱变处理细胞一可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株一扩增培养种子液一厌氧发酵生产L-丙氨酸一发酵液净化处理一制得成品，具体步骤如下。A、活化出发菌将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42°C培养至对数生长期，用0. 85 %的生理盐水制成菌悬液，稀释至ImL菌悬液含菌数约为107，镜检菌种健壮且无杂菌后，吸取0. ImL菌悬液均匀涂布于无菌空白培养皿上，无菌风吹干制成菌膜。B、低能离子注入诱变法诱变处理细胞镜检无细胞重叠后，真空条件下对菌体细胞进行离子注入处理，注入离子为N离子，剂量为I. 5X 1014-5X IO16 ions/cm2,能量为15-20keV，脉冲注入，每次注入5s，间隔时间15_40s ;将经过离子注入处理后的菌膜用ImL 无菌生理盐水进行洗脱，然后取0. ImL洗脱液涂布于固体平板上，置于37 °C培养箱中培养48h。 C、可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株挑选离子注入后的单菌落进行编号，并接种到对应编号的发酵培养基中，发酵液PH值在6. 5-7. 5，37 1厌氧发酵48h ;将发酵液过滤除去菌体，滤液经121°C蒸汽灭菌20min，加入I. 5%琼脂，115°C蒸汽灭菌20min后，加入0. 01-0. 05%抑制剂，倒平板，并涂布指示菌，置于35-40°C培养箱中进行培养；选取指示菌生长的平板所对应的编号的突变菌株进行连续传代培养，通过稳定性试验，最终得到两株编号为0108和Zofe. 1109的L-丙氨酸高产菌株。D、扩增培养种子液'Lds. 0108和Zofe. 1109分别依次通过斜面培养和种子罐培养，培养温度37°C，斜面培养时间24h，种子罐培养时间18h。E、厌氧发酵生产L-丙氨酸将扩增后的种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖浓度为6-12%，发酵温度为35-40°C，培养基pH值为6. 5-7. 5，维持厌氧环境，待残糖浓度小于0. 1%则发酵完成，发酵时间30-52h。F、发酵液净化处理先采用陶瓷超滤膜或有机管式超滤膜过滤，然后通过纳滤膜进一步过滤。G、制得成品纳滤液经过真空浓缩蒸发，结晶析出L-丙氨酸，经离心，干燥得成品。本专利技术的有益效果是乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种作为出发菌种，在厌氧条件下具有较高的糖酵解能力，在实际应用过程中会节约大量的动力成本，且该菌种作为食品级菌种，其发酵产生的乳酸与丙氨酸是结构类似物，会大大提高正突变的效率。采用的低能离子注入诱变法具有突变谱广、死亡率低、正突变率高、性状稳定等优点。所用的原材料葡萄糖属于可再生纯天然资源，来源广泛，价格低廉，且厌氧发酵减少了动力消耗，降低了生产成本。提纯过程中使用超滤膜过滤和纳滤膜过滤去除杂质，保证了产品质量，适合大规模工业化生产。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术以乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种iLac tobaciIlus delbrueckiisubsp. bulgaricus)为出发菌种,经活化出发菌一低能离子注入法诱变处理细胞一可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株一扩增培养种子液一厌氧发酵生产L-丙氨酸一发酵液净化处理一制得成品等步骤，可知实施过程主要分为两个阶段，首先是产L-丙氨酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株的诱变，然后利用筛选出来的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株Zofe. 0108和Zofe. 1109发酵生产L-丙氨酸。实施例1-1 :产L-丙氨酸的德氏乳杆菌保加利亚亚种突变株的诱变。I、培养基组分。I. I斜面培养基的成分蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，琼脂I. 5%，氢氧化钠调pH至I. 0,121°C蒸汽灭菌20min。I. 2发酵培养基的成分葡萄糖6%，磷酸二氢钾0. 2%，磷酸氢二钾I. 2%，无水硫酸镁0. 02%，氨水调pH至7. 0，115 °C蒸汽灭菌20min。 为避免对下步筛选L-丙氨酸产生菌造成干扰，在发酵培养基配制过程中，无任何含丙氨酸的有机物掺入。2、操作步骤。2. I活化出发菌将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42°C培养18h左右，至对数生长期，用0. 85%的生理盐水制成菌悬液，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱变乳酸产生菌生产L-丙氨酸的方法，其特征在于，以乳酸产生菌德氏乳杆菌保加利亚亚种delbrueckii subsp.■为出发菌种,活化出发菌—低能离子注入法诱变处理细胞一可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株一扩增培养种子液一厌氧发酵生产L-丙氨酸一发酵液净化处理一制得成品，包括如下具体步骤 A、活化出发菌将出发菌德氏乳杆菌保加利亚亚种在斜面培养基上42°C培养至对数生长期，用0. 85%的生理盐水制成菌悬液，稀释至ImL菌悬液含菌数约为107，镜检菌种健壮且无杂菌后，吸取0. ImL菌悬液均匀涂布于无菌空白培养皿上，无菌风吹干制成菌膜； B、低能离子注入诱变法诱变处理细胞镜检无细胞重叠后，真空条件下对菌体细胞进行离子注入处理，注入离子为N离子，剂量为I. 5 X 1014-5 X IO16 ions/cm2,能量为15_20keV，脉冲注入，每次注入5s，间隔时间15-40S ;将经过离子注入处理后的菌膜用ImL无菌生理盐水进行洗脱，然后取0. ImL洗脱液涂布于固体平板上，置于37 °C培养箱中培养； C、可逆抑制测定法筛选生产L-丙氨酸的突变株挑选离子注入后的单菌落进行编号， 并接种到对应编号的发酵培养基中，发酵液PH值在6. 5-7. 5，37 1厌氧发酵48h ;将发酵液过滤除去菌体，滤液经121°C蒸汽灭菌20min，加入I. 5%琼脂，115°C蒸汽灭菌20min后，力口A 0. 01-0. 05%抑制剂，倒平板，并涂布指示菌，置...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建坡，苗位云，孟凡会，刘焕书，朱传厚，韩秀丽，郭志远，徐龙，
申请(专利权)人：淮北新旗氨基酸有限公司，
类型：发明
国别省市：