重组乳酸菌及SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用制造技术

本发明专利技术涉及重组乳酸菌及SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。本发明专利技术的目的是提供以重组乳酸菌L.lactisNZ9000 pCYT:SNase为载体的疫苗所具有的在抗1型糖尿病作用中的新应用。该重组菌经乳糖诱导之后能够表达目的蛋白葡萄球菌核酸酶Staphylococcal nuclease,SNase。通过口服给药的方式将L.lactisNZ9000 pCYT:SNase活菌疫苗免疫4周龄雌性NOD/LtJ小鼠，并对一系列药效学指标进行评估，发现：与对照组相比，口服L.lactisNZ9000 pCYT:SNase可以明显降低NOD小鼠糖尿病的发病率，能够较好地控制NOD小鼠的血糖和体重，并且显著提高NOD小鼠的生存率。由此可知，重组乳酸乳球菌L.lactisNZ9000 pCYT:SNase可以明显抑制NOD小鼠糖尿病的发生发展，可用于1型糖尿病药物的开发。

【技术实现步骤摘要】
重组乳酸菌及SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用
本专利技术涉及一种具有抗1型糖尿病作用的重组乳酸菌，以及含有该重组乳酸菌的衍生物和类似的药物制剂，本专利技术涉及药学及医学相关领域。
技术介绍
糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是由于胰岛素绝对或相对不足而引起的、以高血糖和多发并发症并存等为特点的内分泌代谢性疾病,是最常见的慢性病之一。通常将糖尿病分为两大类型，1型糖尿病（Type1diabetesmellitus，T1DM）和2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）。T1DM通常被认为是一种以遗传为基础的，多因素共同参与的，器官特异性自身免疫疾病。患者胰岛β细胞受到T淋巴细胞介导的免疫损伤，导致胰岛素分泌绝对不足。同时T1DM也是大量未知的环境因素综合影响的结果，比如病毒感染、饮食等，但其致病机制至今尚未明确。患者主要症状是三多一少，即多饮、多食、多尿、体重减轻。目前，对于T1DM的治疗仍多采用注射胰岛素的方法，但是对大多数患者而言，胰岛素治疗不仅无法将患者血糖水平时刻维持在正常范围内，还有发生急性低血糖的危险，更无法从根本上改善或终止T1DM的主要病因——免疫调节紊乱，而且频繁的皮下注射，有创性的血糖监测等都是长期胰岛素注射治疗的制约因素，并且常规免疫抑制剂并不能直接做降糖药物，应用于临床，因此说明T1DM是一个复杂、多因素引起病症，仅仅免疫抑制并不能起到良好效果，故找到新靶点，研究新的治疗方法势在必行。乳酸菌长期应用于食品工业各个领域，比如发酵制品的生产和保存，已被证明无致病性，是一种公认的安全级（generallyrecognizedassafe,GRAS）微生物。目前，对于乳酸菌来说，除了利用基因工程菌进行食品发酵之外，其作为载体递呈治疗性蛋白或抗原的功能已成为研究热点。乳酸菌NZ9000是乳酸乳球菌Lactococcuslactissubsp.cremorisMG1363的衍生菌株。它是1998年由Kuipers等将表达乳酸链球菌素（nisin）的调控基因nisR和nisK整合到MG1363的氨基肽酶N基因(pepN)中构建而成(pepN::nisRnisK)。由于其诸多优点，现已广泛用于外源蛋白的表达，并且作为活载体疫苗递呈抗原。比如，其生理生化特点简单；遗传背景清楚；抗原性弱；菌体自身分泌蛋白少，降低对外源分泌蛋白的干扰；不产生内毒素；不产生任何细胞外蛋白酶，避免分泌蛋白发生细胞外降解；安全性高，2010年，Lee等首次从毒理学角度评估了NZ9000的安全性，证明NZ9000不含抗药性基因，不产生毒性蛋白。NZ9000表达系统通常采用NICE（nisin-controlledexpression,NICE）表达系统，即nisin诱导的基因表达系统。该表达系统应用广，可控性强。有效的NICE系统主要包括带有nisRK基因的宿主菌、含有PnisA或PnisF启动子片段的质粒（含有可插入目的基因的多克隆位点）以及作为诱导物的nisin或其类似物。pCYT:SNase（文献为pCYT:NUC）是常用的nisin诱导的外源基因表达载体，其带有氯霉素抗性，含有PnisA启动子，若在其多克隆酶切位点中插入目的基因，就能够在nisin诱导下进行外源目的蛋白的表达。其中的nuc基因编码的SNase常被作为报告蛋白（reporter）监测蛋白靶定和构象状态。SNase分子量小，遗传背景和生化性质清楚，稳定性好，不易变性，活性易于检测，当作为表达标签与目的蛋白融合表达时，一方面不会影响目的蛋白的活性，另一方面可以降低胞内酶对目的蛋白的降解作用。所述的SNase为葡萄球菌核酸酶（Staphylococcalnuclease)，属于最早发现的一类非特异核糖核酸酶，成熟形式的SNase由149个氨基酸残基组成，其中同源序列SNc含有135个氨基酸残基，催化位点含有67个氨基酸残基，能够非特异性地降解DNA和RNA，并释放出3’-磷酸单核苷酸和二核苷酸，它同时具有外切酶和内切酶活性，另外与其他DNase相比还具有分子量小、热稳定性好、pH活性范围广（pH4~10）等优点。上述pCYT:SNase是常规载体，目前并没有任何降血糖的报道。本专利技术首次发现SNase或含有SNase的乳酸乳球菌表达菌株即L.lactisNZ9000pCYT:SNase具有降血糖作用，并且乳酸乳球菌表达菌株即L.lactisNZ9000pCYT:SNase可以口服，克服了胰岛素等不能口服等难题。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的是提供表达SNase的重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase的新用途。技术方案：SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。一种重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用。本专利技术涉及的重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase,即乳酸乳球菌NZ9000pCYT:SNaseLactococcuslactisNZ9000pCYT:SNase保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学;保藏号为CCTCCNO：M2016084，保藏时间为2016年3月4日。所述的以重组乳酸菌或SNase为有效成分的制剂为含有重组乳酸菌以及SNase的注射剂、缓释剂、皮下埋植剂、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊或者口服液。一种检测试剂盒，其特征含有所述的重组乳酸菌或SNase。本专利技术所提供的重组乳酸乳球菌可为LactococcuslactisNZ9000型，也可为其它许可在人体使用的乳酸菌。本专利技术所提供的表达载体也可为其它许可在人体使用的乳酸菌表达载体。有益效果：1、本专利技术采用葡萄球菌核酸酶（Staphylococcalnuclease,SNase)首次发现其具有降血糖作用。并且发现重组乳酸菌L.lactisNZ9000pCYT:SNase也具有降糖作用，并且可以口服给药，本专利技术涉及其新用途。2、现有技术表明诸多如HSP65之类的蛋白可用于1型糖尿病的防治，工程菌对于此类蛋白的表达打破了其难以大批量生产的桎梏，但是也存在其他的问题，例如在分离纯化过程中融合蛋白的降解，调控操作条件严格，纯化效率过低等。此专利技术采用乳酸乳球菌来递送目的蛋白，使得蛋白在机体中进行表达，巧妙地规避了蛋白降解以及纯化步骤繁琐复杂的问题，节约了生产成本，对于大规模的生产以用于1型糖尿病的防治具有重要意义。传统疫苗一般是通过皮下注射的方式进行给药，但是皮下注射对病患而言过于痛苦，所以难以被接受，另外，这种给药方式还存在严重的安全性问题。而本专利所涉及的重组乳酸菌通过口服给药，黏膜吸收的方式，克服了上述的种种局限，易于为病患接受。乳酸菌长期应用于食品工业各个领域，已被证明无致病性，是一种公认的安全级（generallyrecognizedassafe,GRAS）微生物。乳酸乳球菌是乳酸菌的模式菌株，其作为表达外源蛋白的理想载体有其独特的优势：首先,常用的疫苗载体，如沙门氏菌、大肠杆菌和痘病毒等，大多数是病原菌，具有一定危险性，而乳酸乳球菌是一种食品级微生物，尤其是对于特定人群如老年人、婴幼儿来说有更好的安全性；其次乳酸乳球本文档来自技高网...

【技术保护点】
SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用，所述的SNase的核苷酸序列为SEQ NO.1。

【技术特征摘要】
1.SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用，所述的SNase的氨基酸序列为SEQIDNO.1。2.一种重组乳酸乳球菌（L.lactis）NZ9000pCYT:SNase在制备预防或治疗1型糖尿病药物中的应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，保藏号为CCTCCNO：M20...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴洁，郎君超，刘坤锋，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32