一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术方法通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达了来源于干酪乳杆菌L.casei Zhang的argG和argH基因，得到了一株乙醇胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis NZ9000(pNZ-argH)。在5％乙醇胁迫条件下，重组菌株L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和L.lactis NZ9000(pNZ-argH)相对于对照菌株生物量分别提高了25.7％和21.2％；15％乙醇胁迫5h后，存活率分别为对照菌株的5.97和4.65倍。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于生物工程

技术介绍
乳酸菌作为一类重要的工业微生物，菌体及其代谢产物广泛应用于食品、医药、饲 料、精细化学品等工业领域中。在工业生产中以及作为益生菌在人体胃肠道系统中都不可 避免的面临着来自外界环境的多种环境胁迫，包括酸胁迫、乙醇胁迫、氧胁迫、盐胁迫等，严 重限制着乳酸菌生长性能和发酵力。 乙醇属有机溶剂，对菌体的毒害主要表现在对细胞膜的破坏上。乙醇渗入膜结构 改变它们的组织和功能，乙醇不仅抑制细菌的生长，乙醇浓度过高还会影响菌体的新陈代 谢、生理活性、影响基体的酶活性等，甚至导致菌体死亡。因此，提供一种提高乳酸菌乙醇胁 迫抗性的方法尤为重要。 本专利技术通过在乳酸乳球菌中过量表达ArgG和ArgH蛋白，调节天冬氨酸到精氨酸 的代谢通路，从而实现了乳酸乳球菌对于乙醇胁迫抗性能力的提高。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术提供了一种提高乳酸菌抵御乙醇胁迫的方法，从而提 高乳酸乳球菌对于乙醇胁迫条件的适应能力。 本专利技术的第一个目的是提供，是在乳酸菌中 过表达精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。 在本专利技术的一种实施方式中，所述ArgG的氨基酸序列是SEQIDNO. 1所示的序 列。 在本专利技术的一种实施方式中，所述ArgG的核苷酸序列是SEQIDN0. 2所示的序 列。 在本专利技术的一种实施方式中，所述ArgH的氨基酸序列是SEQIDN0. 3所示的序 列。 在本专利技术的一种实施方式中，所述ArgH的核苷酸序列是SEQIDN0. 4所示的序 列。 在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌为乳酸乳球菌。 在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是将编码ArgG或者ArgH的基因序列连接 到表达载体上获得重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主乳酸菌中并诱导重组菌表达ArgG 或者ArgH，再将重组菌置于乙醇胁迫环境中。 在本专利技术的一种实施方式中，所述诱导重组菌表达是将在GM17培养基中，使用 nisin(-种乳酸链球菌素）进行诱导。 在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体为pNZ8148、pNZ8149或pNZ8150。 在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主乳酸菌为LactococcuslactisNZ9000。 本专利技术还提供一种乙醇胁迫抗性提高的重组乳酸菌，其特征在于，所述重组乳酸 菌过表达了精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。 在本专利技术的一种实施方式中，所述重组乳酸菌以LactococcuslactisNZ9000为 宿主、PNZ8148为载体过表达了氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示的ArgG。 本专利技术的有益效果： 通过采用在乳酸菌中过量表达精氨酰琥珀酸合成酶（ArgG)或精氨酰琥珀酸裂解 酶（ArgH)的方法，显著提高了乳酸菌的乙醇胁迫抗性能力。采用本专利技术方法，在5%乙醇胁 迫条件下，使重组菌株 L.lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000(pNZ-argH)相对 于对照菌株的生物量分别提高了 25. 7%和21. 2%;同时，过表达ArgG或ArgH的重组菌，在 15%乙醇胁迫5h后，存活率分别为对照菌株的5. 97和4. 65倍。【附图说明】 图1 :重组质粒pNZ8148-argH的结构图； 图2:重组菌株蛋白电泳图；其中，M:蛋白Marker;G:L.lactis NZ9000(pNZ-argG)；H：L.lactisNZ9000(pNZ-argH)；VEC：L.lactisNZ9000(pNZ8148)； 图3 :5%乙醇胁迫条件下，重组菌株与对照菌株生长性能对比； 图4 :15%乙醇胁迫条件下，重组菌株与对照菌株存活率对比。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术做更详细的说明。 实施例1重组菌株的构建 从NCBI数据库的L. casei Zhang中得到ArgG和ArgH蛋白的基因序列（分别如 SEQ ID NO. 2、SEQ ID N0. 4所示），并将其克隆到乳酸乳球菌表达质粒pNZ8148上，获得重 组质粒pNZ8148-argG和pNZ8148-argH，再将其电转入宿主菌L. lactis NZ9000中，得到重 组菌株 L.lactis NZ9000 (pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000 (pNZ-argH) 〇 具体如下： 根据argG和argH的基因序列分别设计引物ArgGF、ArgGR、ArgHF和ArgHR(表1)， 以L. casei Zhang的基因组为模板进行PCR扩增，获得argG和argH基因片段。将PCR产 物和载体PNZ8148分别用Spe I和Sph I双酶切，酶切产物经纯化后，进行连接。连接产物 电转化L. lactis NZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶 切验证，片段大小正确后，经测序验证正确后最终获得含有正确重组质粒的菌株L. lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000(pNZ-argH)〇 电转化条件为：1 yL质粒中与40 yL的感受态细胞混合，移入预冷的电转杯中， 冰上放置l〇min。电压2000V，电容25yF，电阻200Q。电击完毕后，立即向电转杯中加入 lmL含有20mM MgCljP 2mM CaCl 2的GM17培养基（GM17培养基配方：M17培养基+0. 5% glucose)。然后置于30°C静置培养1. 5h，涂布于含有氯霉素的GM17平板上，培养36h，挑取 转化子验证。 表1引物 实施例2ArgG和ArgH蛋白的诱导表达与检测 诱导重组菌L.lactisNZ9000(pNZ-argG)和L.lactisNZ9000(pNZ-argH)表达 ArgG和ArgH蛋白，并用SDS-PAGE蛋白电泳检测重组菌株中ArgG和ArgH蛋白的表达情况， 发现与ArgG和ArgH蛋白大小相似的条带的量显著增加。 具体过程如下：将菌株 L. lactis NZ9000 (pNZ8148)(即含有 pNZ8148 空质粒的 L. lactis NZ9000 菌株）和重组菌 L. lactis NZ9000(pNZ-argG)和 L. lactis NZ9000(pNZ-argH)接种于含有 10 y g/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30°C静置培养过夜，以4%的接种量转接至50mL 含有10 y g/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至0D6M0. 4时加入10ng/mL的nisin (-种 乳酸链球菌素）诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mM Tris-HCl缓冲液（pH 7.4)离心 洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液， 进行SDS-PAGE分析。 经SDS-PAGE分析，重组菌 L.lactisNZ9000 (pNZ-argG)和 L.lactis NZ9000 (pNZ-argH)分别成功的表达了ArgG和ArgH蛋白。SDS-PAGE中，在分子量约为45kDa 和52kDa处的蛋白质条带显著变厚重，与目标蛋白ArgG和ArgH的分子量基本一致，说明成 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高乳酸菌乙醇胁迫抗性的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过表达精氨酰琥珀酸合成酶ArgG或者精氨酰琥珀酸裂解酶ArgH。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，陈坚，张明阳，堵国成，朱政明，唐诗，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32