本发明专利技术涉及一种利用噬菌体PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因转化制备鸭疫里默氏菌前菌影疫苗的方法与应用方法。该方案首先将噬菌体PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因通过柔性连接臂(Gly4Ser)3连接成串联基因，并进一步构建温控表达载体pBV-E-SN。将pBV-E-SN电击转化进入鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆28℃增菌培养。分离菌体加保护剂后分装、冷冻干燥。本发明专利技术所制备的活菌疫苗经饮水免疫，既可以刺激呼吸道和消化道黏膜的局部免疫，也可以激发体液免疫。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家禽养殖疫病防控领域，涉及一种细菌疫苗的制备方法，尤其是涉及 一种利用噬菌体PhiX174的E基因和葡萄球菌核酸酶A基因转化制备鸭疫里默氏菌前菌影 疫苗的方法与应用方法。
技术介绍
鸭传染性衆膜炎，是由鸭疫里默氏菌（/PieffiereJ7a RA)引起的 鸭、鹅、火鸡及其它家禽和野禽的一种急性或慢性接触性传染病，主要侵害2-7周龄雏鸭， 以神经症状和纤维素性心包炎、肝周炎和气囊炎为特征。 当前，鸭疫里默氏菌感染对养殖业的危害，除了直接引起动物的发病和死亡外，隐 性感染导致的饲料转化率降低、生长迟缓而带来的间接经济损失也十分严重。鸭疫里默氏 菌虽然对一些抗生素敏感，但机体内难以完全清除；同时由于抗生素的不合理使用，其耐药 性日益增强，往往导致禽肉产品的药物残留问题日益突出。防控该病的科学方法，是在强化 饲养管理的基础上，接种合适的鸭疫里默氏菌疫苗。 尽管目前关于鸭疫里默氏菌的疫苗方面已经有了许多研宄报道，例如，鸭疫里默 氏菌灭活苗、多价复合佐剂灭活疫苗以及新型菌影疫苗等。但仍然存在以下几方面的问题： ①传统的疫苗制备技术，通过甲醛等化学药物灭活过程中改变抗原结构，而减弱了免疫原 性，致使免疫保护率降低。②目前所报道的疫苗，均是通过注射免疫，免疫应激大，而且，在 规模化养殖条件下，免疫操作费时费力。③灭活苗只能引起体液免疫，不产生或仅产生轻微 的细胞免疫和局部黏膜免疫，不能提供可靠的抵抗感染的黏膜免疫屏障。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供了一种利用噬菌体PhiX174的E基 因以及葡萄球菌核酸酶A基因转化鸭疫里默氏菌临床分离株，制备新型鸭疫里默氏菌前菌 影疫苗及其应用的技术方案。本专利技术所提供的技术方案对有效防治鸭疫里默氏菌感染，以 及减少家禽养殖过程中抗菌药物的使用、减少药物残留等具有重要意义。 为了解决
技术介绍
所存在的问题，本专利技术是采用以下技术方案： 选择本实验室鉴定保存的2型鸭疫里默氏菌临床分离株(编号为LY1)作为基础菌株。 该菌株经过3代接种雏鸭复壮之后仍无致病性，因而使用安全。冷冻保存的菌株复苏后，按 常规试验方法制备成原生质体备用。 利用常规分子生物学技术，将噬菌体PhiX174的E基因（简称E)与葡萄球菌核酸 酶A基因（简称SN)通过编码柔性连接臂（Gly4Ser) 3的Linker连接，获得E、SN的串联基因 E-SN，进一步将其与温控表达载体pBV220连接，构建温控表达载体pBV-E-SN。将pBV-E-SN 按常规试验方法电转化制备的鸭疫里默氏菌原生质体，筛选阳性克隆得到鸭疫里默氏菌重 组工程菌。 将得到的鸭疫里默氏菌工程菌常规方法28°C扩菌培养，分离菌体，与冻干保护剂 等体积混合均匀，洁净环境下分装于IOmL西林瓶，冷冻干燥，即得到鸭疫里默氏菌前菌影 疫苗。 冻干保护剂的配方由以下重量份的组分构成：脱脂乳8-12份，蔗糖2-6份，海藻糖 3-10份，抗坏血酸2-6份，丙三醇12-20份，纯化水50-70份。 进一步优选的，冻干保护剂由以下重量份的组分构成：脱脂乳8-10份，蔗糖2-4 份，海藻糖3-8份，抗坏血酸2-4份，丙三醇12-16份，纯化水60-70份。 通过饮水免疫，该疫苗在温度较低的上呼吸道正常繁殖，刺激呼吸道局部黏膜免 疫应答（SIgA)，并逐渐被清除；上呼吸道所繁殖的细菌及进入消化道的细菌部分突破黏膜 屏障进入血液，随即诱导所携带的温控表达载体产生裂解基因产物。其中，E基因产物在细 菌细胞膜形成跨膜孔道，细菌内容物流出而形成菌影，继续刺激机体产生细胞免疫和体液 免疫；SN基因产物将细菌DNA降解成小于IOObp的片段，将细菌彻底灭活。 与现有技术相比，本专利技术涉及的利用温控双裂解基因制备鸭疫里默氏菌前菌影疫 苗具有如下优点和显著进步： (1)与传统灭活疫苗相比，形成菌影之前(在呼吸道繁殖阶段）以及进入机体内形成菌 影之后，细菌表面结构基本完整，抗原性基本不受影响，免疫保护率高。 (2)本专利技术所提供的鸭疫里默氏菌前菌影疫苗，通过饮水免疫，避免了注射免疫的 应激，应用方便，适应规模化养殖。 ( 3)传统灭活疫苗以及目前所报道的有关鸭疫里默氏菌菌影疫苗，通过注射免疫， 只能引起体液免疫反应，保护效果有一定局限性。本专利技术所提供的技术方案，利用鸭体不同 部位的温度差异，制备的鸭疫里默氏菌前菌影在温度较低的呼吸道不会诱导裂解基因的表 达，因而能够正常繁殖并刺激呼吸道局部的黏膜免疫反应；进入机体内的菌苗由于温度的 升高（41°C - 42°C)，裂解基因随即开始表达，从而形成菌影刺激机体产生体液免疫和细胞 免疫。由于呼吸道的黏膜免疫反应（SIgA)时相变化，在SIgA升高至足以清除接种的疫苗 菌株之前，会有细菌持续进入机体形成菌影激发体液免疫反应，起到类似油佐剂灭活疫苗 的缓释作用。因而，本专利技术所提供的方案既可引起呼吸道和消化道的黏膜免疫反应而提供 抵抗细菌感染的第一道防线，也可以引起体液免疫反应而提供持续的保护。 (4)利用温控诱导表达的串联双裂解基因，使进入机体内部的绝大部分细菌形成 菌影失去活性而保留免疫原性，少数未能及时形成跨膜孔道的细菌，其DNA被SN迅速降解 为小片段而失活。另外，选择的菌株为低致病性临床分离株，三重保障确保疫苗使用的安全 性。【具体实施方式】 以下是本专利技术的具体实施例，对本专利技术的技术方案做进一步描述，但是本专利技术的 保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本专利技术构思的改变或等同替代均包括在本专利技术 的保护范围之内。 实施实例一：鸭疫里默氏菌前菌影的制备 1.1临床分离株的毒性验证将一株从临床蛋鸭中分离的鸭疫里默氏菌(编号为LY1) 经血清型鉴定为2型的菌株进行了毒力验证。该菌株不产生明胶酶，接种雏鸭连续3代未 表现出致病性，但用同型强毒攻击能产生90%以上的保护力，说明该菌株是一株无致病力 或致病力较低又具有良好免疫原性的菌株，可作为疫苗候选株。 原生质体的制备将LYl菌株活化后，培养至OD6c?为0. 7时，将菌液置于冰水浴 中30min，取IOmL菌液，4°C条件下5000r/min离心10min，弃上清，用IOmL冰水浴灭菌水洗 涤，再次离心，如此重复洗涤三次。再用冰水浴高渗缓冲液悬浮，加入预热的溶菌酶溶液至 5mg/mL，37°C水浴30min后，再加入预热的EDTA溶液至0.0 lm当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备鸭疫里默氏菌前菌影疫苗的方法，其特征在于：利用噬菌体PhiX174的E基因（简称E）与葡萄球菌核酸酶A基因（简称SN）构建温控双裂解基因pBV‑E‑SN，将其电转化鸭疫里默氏菌原生质体，筛选得到阳性克隆。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘文华，刘宗柱，任慧英，韩先杰，邹玲，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：山东;37
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