一种从棉子糖乳球菌次级代谢物中分离活性化合物的方法技术

本发明专利技术公开了本发明专利技术从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。

A method for separation of active compounds from raffinose secondary metabolites in Lactococcus lactis

The invention discloses a kind of active compounds isolated from a strain of raffinose lactis secondary metabolites, and by optimizing the culture conditions, can efficient production of the compound, low cost. It has been proved that the active compound has significant hypolipidemic effect and whitening effect.

【技术实现步骤摘要】
一种从棉子糖乳球菌次级代谢物中分离活性化合物的方法
本专利技术涉及一种从棉子糖乳球菌次级代谢物中分离活性化合物的方法，属于生物领域。
技术介绍
天然产物是药物先导化合物发现的重要来源，近年来，越来越多的天然产物化学家把目光投向生物种类更加多样的微生物。本专利技术从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术的一个目的在于提出从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。本专利技术人从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，在MRS液体培养基中培养24-72h，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)经鉴定，化合物1的结构式为：本专利技术人还惊讶地发现，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。本专利技术的有益之处在于：本专利技术从一株棉子糖乳球菌次级代谢物中分离出一种活性化合物，并通过优化培养条件，可以高效生产该化合物，成本低。经鉴定，该活性化合物具有显著的降血脂作用，还具有美白作用。附图说明图1为黑色素代谢原理图。具体实施方式下面详细描述本专利技术的实施例，所述实施例仅用于解释本专利技术，而不能理解为对本专利技术的限制。实施例1：本专利技术人从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，在MRS液体培养基中培养24-72h，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，化合物1(3.5mg)、化合物2(8.1mg)经鉴定，化合物1为淡黄色粉末，溶于二氯甲烷，分子式为C13H14O3；mp.60摄氏度，化合物1的结构式为：其核谱数据如下所示：经检索核实，和已知文献报告过的化合物一致(天然产物研究与开发NatProdResDev2014，26:159-161)，但是该文献没有对该化合物的功能进行研究。实施例2：本专利技术人对实施例1的发酵方法进行改进，发现可以大幅提高该化合物的产量，为低成本工业化生产提供了可能性。本专利技术基于如下发现：特定浓度范围的甘草查尔酮B配合特定的温度曲线，可以令人惊讶地大幅提高该化合物的产量。甘草查尔酮B购自上海丽臣公司，纯度＞98％。从广东微生物保藏中心购得一株棉子糖乳球菌，其编号为：GIM1.1015，根据保藏中心的记载，该菌株的其他编号为：JCM5706。＝ATCC43920＝CGMCC1.1935＝DSM20443＝NBRC100932。对该株棉子糖乳球菌进行培养，接种进modified-MRS液体培养基中培养48h：前18h保持35摄氏度；第19-22h保持18摄氏度，第23-48h保持30摄氏度培养；所述modified-MRS液体培养基为MRS+0.002％甘草查尔酮B，共发酵100L。过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取，减压浓缩后得到乙酸乙酯层浸膏20g，经300目硅胶柱层析，二氯甲烷-甲醇(3:1-1:2)梯度洗脱，合并相同组分，各组分再经反复硅胶层析，SephadexLH-20和RP-18反相柱色谱分离纯化以及C18高效液相制备得两种化合物，化合物1(36.8mg)、化合物2(8.1mg)。实施例3：法尼酯X受体(FXR)是一种核受体，在体内与配体结合后，通过激活下游靶基因的转录对体内生理过程产生广泛的调节作用，其中最重要的是维持体内胆汁酸和胆固醇的稳态。另外它还能够调节糖类和脂质代谢。目前已有两个以FXR为靶标的小分子化合物进入三期临床，用于治疗原发性胆汁酸性肝硬化和高血脂症。另外，研究表明治疗2型糖尿病的药物曲格列酮也是一种FXR拮抗剂【参见：Kaimal,R.；Song,X.；Yan,B.；King,R.；Deng,R.DifferentialmodulationoffarnesoidXreceptorsignalingpathwaybythethiazolidinediones[J].J.Pharmacol.Exp.Ther.2009,330,125-134】。因此，作用于FXR的小分子化合物有望被开发成为治疗代谢性疾病的药物。化合物的浓度分别为1μM,5μM，所用的细胞系是293T细胞。取对数期293T细胞以25,000/孔接种至96孔板。过夜培养后，表达载体pCMV-GAL4-DBD-hFXR-LBD(5ng/孔)，pFR-Luciferase报告基因(25ng/孔)以及Renilla-Luciferase(RL)质粒(5ng/孔)，按照0.25μL/孔的Lipofectamine进行瞬时转染。转染18小时后，用含有CDCA(25μM)的0.5％活性炭处理的FBS的MEM培养液，然后加入5μM化合物1。继续培养24小时后，根据Dual-Luciferase报告基因说明书检测Luciferase酶活性。以RL酶活性为内参。化合物1的FXR拮抗活性如下表所示：Antagonistrate(％)1μM22.75μM93.8这表明，细胞转染和荧光报告实验表明化合物1在5μM浓度下，能够对CDCA(鹅去氧胆酸，FXR内源性配体)诱导的法尼酯X受体激活产生强烈的拮抗作用。实施例4：对KKay糖尿病小鼠血脂的的调节作用药效学实验：通过体内实验确证了化合物1能够显著降低糖尿病模型小鼠的甘油三酯水平。实验所使用的动物模型是自发性2型糖尿病KKay小鼠，雌性(购于中国医学科学院动物中心)。依据胰岛素耐量实验，按空腹血糖、体重、血浆甘油三酯和胆固醇水平随机分为2组，分别为模型对照组(Con)、f给药组(50mg/kg)。每天灌胃给药一次，连续给药21天后测定血脂水平。给药组的血浆甘油三酯水平较对照组下降28.3％(p<0.05)。动物实验结果表明化合物1能够显著降低糖尿病小鼠的甘油三酯水平，具有开发成抗糖尿病药物的潜力。具体数据如下所示：甘油三酯(mg/dl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种化合物1的生产方法，其特征在于：所述化合物1的分子式为：

【技术特征摘要】
1.一种化合物1的生产方法，其特征在于：所述化合物1的分子式为：所述生产方法为发酵棉子糖乳球菌来产生。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于：对该株棉子糖乳球菌进行培养，接种进modified-MRS液体培养基中培养48h：前18h保持35摄氏度；第19-22h保持18摄氏度，第23-48h保持30摄氏度培养；所述modified-MRS液体培养基为MRS+0.002%甘草查尔酮B，共发酵100L,过滤、浓缩后得到水相10L，用乙酸乙酯进行萃取...

【专利技术属性】
技术研发人员：石佳明，
申请(专利权)人：石佳明，
类型：发明
国别省市：河北,13