PGB基因变体在增加癌症化疗药物敏感度中的应用制造技术

本发明专利技术本发明专利技术首次公开了PGB基因可以用于制备肿瘤细胞化疗增敏药物，有助于提高癌细胞对极低浓度的化疗药物顺铂的敏感性，增强化疗药物的疗效，提高肿瘤患者的生命质量，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。所述PGB变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术实现步骤摘要】
PGB基因变体在增加癌症化疗药物敏感度中的应用
本专利技术涉及PGB基因变体在增加宫颈癌药物敏感度中的应用，属于基因工程领域。
技术介绍
恶性肿瘤是严重危害人类健康的高发病率和高致死率疾病。例如，胶质瘤(glioma)是由神经外胚层分化而来的胶质细胞(星形胶质细胞、少突胶质细胞和室管膜等)引发的肿瘤，在颅内肿瘤中发病率位列第一，而且，因其呈浸润性无限制增生、与正常脑组织无明显界限并富含血管，还具有高复发率和低治愈率。目前对恶性肿瘤的治疗，主要采用手术治疗、放射治疗、化学治疗等相结合的综合治疗方式。尽管随着细胞毒性药物、分子靶向治疗药物、生物反应调节剂、肿瘤血管生成抑制剂等的迅猛发展，部分恶性肿瘤已能通过化学治疗治愈，但由于肿瘤耐药以及抗肿瘤药物本身毒副作用较大导致最大给药浓度较低等问题，化学治疗的疗效至今仍难以令人满意。其中，肿瘤耐药是目前化学治疗的主要障碍，也是困扰肿瘤临床治疗的关键性难题。因此，研究肿瘤耐药的产生与调控机制、发展新的耐药增敏剂是增强化疗药物疗效、提高肿瘤患者生命质量的重要策略。白菜花粉壁发育相关基因PGB2是一种植物基因，已被现有技术公开(2008100605812)，但是现有技术仅仅公开了其与白菜花粉壁发育相关。
技术实现思路
本专利技术发现定点突变后的PGB基因可极大增强人或动物细胞对化疗药物的敏感性，其能够用于制备肿瘤细胞化疗增敏药物，从而增强肿瘤的临床治疗效果、提高肿瘤患者的生命质量。本专利技术的目的通过以下技术方案实现：本专利技术通过高宽容PCR以及定点突变技术，获得PGB基因突变库，通过评估其在恶性肿瘤中的效果，发现一个PGB基因变体，可极大增强人或动物细胞对化疗药物的敏感性，尤其是对宫颈癌细胞有十分显著的效果。一种PGB基因，具核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。所述PGB基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本专利技术通过实验证明，将PGB基因的重组表达载体转染到人肝癌细胞HepG2、人肺癌细胞A549后，所述癌细胞的生长受到抑制，与对照相比，生长速度有明显降低，同时，对化疗药物顺铂的敏感性大大增强，在较低的化疗药物浓度下(0.2μg/ml)就可达到癌细胞生长受抑制的效果。所述PGB基因的重组表达载体，是将PGB突变基因可操作地连于载体的表达调控序列获得。所述载体可选用本领域已知的各种载体，如病毒载体(逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体)、非病毒载体(质粒、阳离子脂质体和阳离子聚合物)、细菌载体(大肠杆菌Escherichiacoli，沙门氏菌Salmonella，耶尔森氏菌Yersinia，志贺菌Shigella，李氏杆菌Listeria等)，通常选用pcDNA3、pLNCX、pCMV、pEGFP、pSG5、pSV2中的一种。所述的“可操作地连于”表示如下情况：即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。本专利技术的有益之处在于：本专利技术首次公开了PGB基因可以用于制备肿瘤细胞化疗增敏药物，有助于提高癌细胞对极低浓度的化疗药物顺铂的敏感性，增强化疗药物的疗效，提高肿瘤患者的生命质量，在肿瘤治疗领域具有潜在、良好的应用前景。附图说明图1是转染子HepG2-PGB及其对照细胞在37℃下48hr时的生长情况示意图。图2是转染子HepG2-PGB及其对照细胞在37℃下的生长曲线，其中，A图为无顺铂条件下的生长曲线；B图为0.2μg/ml顺铂条件下的生长曲线。图3是转染子A549-PGB及其对照细胞在37℃下48hr时的生长情况示意图。图4是转染子A549-PGB及其对照细胞在37℃下的生长曲线，其中，A图为无顺铂条件下的生长曲线；B图为0.2μg/ml顺铂条件下的生长曲线。图5是转染子HepG2-PGB及其对照细胞在37℃下的生长情况示意图。具体实施方式下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook，Russell的分子克隆：实验室手册(NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中，人肝癌细胞HepG2，人肺癌细胞A549均购自美国模式培养物集存库(ATCC)。所有试剂均为时购获得。实施例1获得变体：通过高宽容PCR，获得PGB基因突变库，通过评估其在恶性肿瘤中的效果，发现一个PGB基因变体，可极大增强人或动物细胞对化疗药物的敏感性。一种PGB基因变体，具核苷酸序列如下所示：实施例2构建真核表达载体：pcDNA.1(+)-Myc为在pcDNA3.1(+)的NheI和HindIII位点之间插入了来自c-Myc的抗原决定族后构建的质粒，来自c-Myc的抗原决定族的序列见SEQIDNO：2。使用限制性内切酶HindIII和EcoRI或其他内切酶，消化纯化后的PGB基因变体(根据内切酶的酶切位点，可在两侧加入酶切位点，可用现有技术任意方法构建重组载体)PCR扩增产物和真核表达载体pcDNA3.1(+)-Myc，消化产物经凝胶电泳、凝胶照像、凝胶切割后，用凝胶纯化试剂盒纯化；纯化后的PCR片段和pcDNA3.1(+)-Myc载体片段在T4连接酶作用下16℃连接时间过夜(连接位点HindIII和EcoRI)；之后将连接产物转化感受态大肠杆菌(E.coli)DH5α，将转化细胞涂布于氨苄平板培养，挑取单菌落，进行菌落PCR检测；得到阳性菌落后，大量培养，提取质粒，进行载体测序检验。测序正确后，即得到真核重组表达载体pcDNA3.1(+)-Myc-PGB。实施例3人宫颈癌细胞HeLa：人宫颈癌细胞HeLa培养使用含有体积浓度10％的胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、体积浓度5％CO2及饱和湿度的条件下培养，常规传代，实验时取对数生长期细胞。在24孔板的孔中按1×105/孔的量接种细胞，将细胞用胰蛋白液消化、计数并铺板；培养24小时后，对于每孔细胞，制备转染混合物：用50μl无血清培养基稀释2.0μl脂质体Lipofectamine2000，室温静置5min；用50μl无血清培养基稀释0.8μg真核重组表达载体pcDNA3.1(+)-Myc-PGB；混合上述两种溶液，室温静置30min，将得到的转染混合物加入24孔板上的目标孔，并依次按以下步骤操作：(1)培养24小时后，1∶10传代入新鲜培养基；(2)在步骤(1)完成后培养24小时，然后往目标孔中加入筛选抗生素G418至800μg/ml；(3)在步骤(2)完成后加入筛选抗生素G418后培养4天，细胞开始大量死亡，仅剩零星细胞，换液，加G418至200μg/ml；(4)在步骤(3)完成后培养7天，可见形成了细胞克隆，消化细胞，稀释至2个细胞/200μl，在96孔板孔中接种稀释的细胞，接种量为200μl/孔；(5)在步骤(4)完成后培养8天，扩大培养规本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PGB变体基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种PGB变体基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述PGB基因在制备治疗肿瘤的药物中的应用。3.权利要求2所述的应用，其中所述肿瘤为宫颈癌。4....

【专利技术属性】
技术研发人员：石佳明，
申请(专利权)人：石佳明，
类型：发明
国别省市：河北,13