新除草剂抗性基因制造技术

本发明专利技术提供不仅对2,4-滴具有抗性，而且还对吡啶氧乙酸类除草剂具有抗性的新植物。迄今为止，还没有预期或提出可通过引入单个基因产生具有这两种有利特性的植物。本发明专利技术还包括这样的植物：其产生与一种或多种其他除草剂抗性基因“叠加”的一种或多种本发明专利技术的酶。本发明专利技术使得可以以新的方式使用除草剂的新组合。此外，本发明专利技术提供预防产生并控制对一种或多种除草剂(如草甘膦)具有抗性的杂草株系的新方法。本发明专利技术用途中优选的酶和基因在本文中称为AAD-12(芳氧基链烷酸酯双加氧酶)。这一高度新颖的发现是重要的除草剂耐性作物性状和选择标记可能性的基础。

【技术实现步骤摘要】
新除草剂抗性基因本申请是专利技术名称为“新除草剂抗性基因”的PCT申请PCT/US2006/042133的分案申请，所述PCT申请的申请日2006年10月27日，进入中国国家阶段的日期为2008年6月30日，申请号为200680050152.6。专利技术背景杂草可以迅速耗尽土壤中作物和其他目的植物所需的有价值的养分。目前有多种不同类型的除草剂用于控制杂草。一种特别流行的除草剂是草甘膦。已经开发了对草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、芸苔、棉花、甜菜、小麦、草坪草和稻。因此可以例如对草甘膦抗性大豆生长活跃的田地喷洒草甘膦以控制杂草而不显著损害大豆植物。随着二十世纪九十年代中期遗传改造的草甘膦耐性作物(GTC)的引入，在农业中前所未有地使种植者能够以简单、便利、灵活且廉价的工具控制广谱阔叶和禾本科杂草。因此，生产者们迅速采用了GTC，并在很多情况下放弃了多种公认最佳的农业实践，如作物轮作、除草剂作用方式轮作、罐混、将杂草的化学防治和栽培防治与机械防治有机结合起来。目前在美国和西半球其他地方可以购买到草甘膦耐性大豆、棉花、玉米和芸苔。苜蓿是第一种引入的多年生GTC，助长了在一定的年限内反复地对相同的作物和田地重复使用甘草膦的可能性。取决于全球市场的接受度，更多的GTC(如小麦、稻、甜菜、草坪草等等)正准备引入。许多其他草甘膦抗性物种正处于实验至开发阶段(如甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡萝卜、黄瓜、莴苣、洋葱、草莓、番茄和烟草；林业物种如白杨和香枫；园艺物种如金盏花、矮牵牛花和秋海棠；参阅站点“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm，2005”)。此外，近年来草甘膦的费用已经急剧降低，达到了几乎没有常规杂草控制程序能在价格和性能上与草甘膦GTC系统有效竞争的程度。草甘膦已经在灭生(burndown)地区和其他非作物地区成功用于总植被控制15年以上。在许多情况下(如对于GTC)，可以在连续的3、5、10直至15年中每年使用草甘膦1-3次。这些情况已经导致对草甘膦和GTC技术的过度依赖，并对天然杂草物种中对草甘膦天然更具耐受性或已经发展出抗草甘膦除草剂活性机制的植物施加了高选择压。仅用草甘膦的杂草控制程序的广泛使用正导致对草甘膦抗性杂草的选择，并且正在选择固有地比多数靶物种更能耐受草甘膦的杂草物种后代(即杂草演替)(Powles和Preston，2006；Ng等，2003；Simarmata等，2003；Lorraine-Colwill等，2003；Sfiligoj，2004；Millar等，2003；Heap，2005；Murphy等，2002；Martin等，2002)。尽管草甘膦已经在全球广泛使用15年以上，仅有少数杂草据报道已发展出对草甘膦的抗性(Heap，2005)，然而它们中的大多数都鉴定于过去的5年。抗性杂草包括禾本科植物和阔叶物种一硬直黑麦草(Loliumrigidum)、多花黑麦草(Loliummultiflorum)、牛筋草(Eleusineindica)、假高梁(Sorghumhalepense)、豚草(Ambrosiaartemisiifolia)、小飞蓬(Conyzacanadensis)、野塘蒿(Conyzabonariensis)、长叶车前(Plantagolanceolata)、长芒苋(Amaranthuspalmerii)和Amaranthusrudis。此外，在广泛使用GTC之前并不是农业问题的杂草现在开始大大盛行，并且难于在GTC的范围内(包括＞80％的美国棉花和大豆地区和＞20％的美国玉米地区)控制(Gianessi，2005)。这些杂草演替主要与(但不仅与)难于控制的阔叶杂草一起出现。一些实例包括番薯属(Ipomoea)、苋属(Amaranthus)、藜属(Chenopodium)、蒲公英属(Taraxacum)和鸭跖草属(Commelina)的物种。在种植者要面对草甘膦抗性杂草或演替成更难于控制的杂草物种的地区，种植者可以通过罐混或换用能控制遗漏杂草的其他除草剂来弥补草甘膦的弱点。在许多情况下控制阔叶逃逸的一种流行且有效的罐混伴侣为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-滴)。2，4-滴已经在农业和非作物条件下用于广谱阔叶杂草控制60年以上。已有关于更具耐性物种的个案报道，但2，4-滴仍是全球最广泛使用的除草剂之一。对进一步使用2，4-滴的限制在于它在双子叶农作物(如大豆或棉花)中的选择性极差，因此2，4-滴一般不用于(且一般不靠近)敏感性双子叶作物。此外，2，4-滴在禾本科作物中的用途在某种程度上受限于会发生的作物损伤的性质。2，4-滴和草甘膦的组合已经用于在种植免耕大豆和棉花之前提供更强的灭生处理，然而，由于这些双子叶物种对2，4-滴的敏感性，这些灭生处理必须至少在种植前14-30天进行(Agriliance，2005)。和MCPA一样，2，4-滴是苯氧酸类除草剂。2，4-滴已经用于在许多单子叶作物(如玉米、小麦和稻)中选择性控制阔叶杂草而不严重损伤目的作物植物。2，4-滴是合成的植物生长素衍生物，其作用为使正常的细胞激素内稳态失调，并阻碍平衡的受控生长，然而其确切的作用模式仍不了解。绿草定和氟草烟是吡啶氧乙酸类除草剂，其作用模式也与合成的植物生长素相同。这些除草剂对某些植物具有不同水平的选择性(如双子叶植物比禾本科植物更敏感)。不同植物对这些除草剂的差异代谢是不同水平选择性的一种解释。通常植物缓慢代谢2，4-滴，因此靶位点的不同活性更可能解释植物对2，4-滴不同的应答(WSSA，2002)。2，4-滴的植物代谢一般通过两步代谢实现，通常是羟基化后接着与氨基酸或葡萄糖缀合(WSSA，2002)。随着时间的发展，微生物种群已经发展出降解此特定外来物的有效的替代途径，这导致2，4-滴的完全矿化。对微生物连续应用除草剂选择了能利用除草剂作为碳源生长(从而使其在土壤中具有竞争优势)的微生物。因为这个原因，目前制备的2，4-滴具有相对短的土壤半衰期，并且没有遇到对其后的作物明显的延续效应(carryovereffect)。这促进了2，4-滴的除草剂应用。已经广泛研究了其降解2，4-滴能力的一种生物是真养雷氏菌(Ralstoniaeutropha)(Streber等，1987)。编码矿化途径中第一个酶促步骤的基因为tfdA。参阅美国专利No.6,153,401和GENBANK登录号M16730。TfdA通过α-酮戊二酸依赖性双加氧酶反应催化2，4-滴酸转化成二氯苯酚(DCP)(Smejkal等，2001)。DCP与2，4-滴相比几乎不具有除草剂活性。TfdA在转基因植物中用于向通常对2，4-滴敏感的双子叶植物(如棉花和烟草)赋予2，4-滴抗性(Streber等(1989)，Lyon等(1989)，Lyon(1993)和美国专利No.5,608,147)。已在环境中鉴定了大量编码能降解2，4-滴的蛋白质的tfdA型基因并已保存于Genbank数据库。许多同源物与tfdA类似(氨基酸同一性＞85％)并具有与tfdA相似的酶特性。然而，有大量同源物与tfdA具有显著更低的同一性(25-50％)，但却具有与α-酮戊二酸双加氧酶Fe+2双加氧酶相关的特征性残基。因本文档来自技高网...

【技术保护点】
转基因植物细胞，其含有编码AAD?12蛋白的多核苷酸，所述AAD?12蛋白选自SEQ?ID?NO：2、SEQ?ID?NO：4、SEQ?ID?NO：2变体和SEQ?ID?NO：4变体，其中所述变体具有芳氧基链烷酸酯双加氧酶活性，并与选自SEQ?ID?NO：2和SEQ?ID?NO：4的序列至少95％的序列同一性。

【技术特征摘要】
2005.10.28 US 60/731,0441.选择至少一个转基因植物细胞的方法，其中所述转基因植物细胞含有由SEQIDNO:3组成的编码AAD-12蛋白的多核苷酸，其中所述方法包括向所述转基因植物细胞和/或其附近以及缺少所述多核苷酸的缺陷植物细胞应用芳氧基链烷酸酯除草剂，并允许所述转基因植物细胞和缺陷植物细胞生长。2.权利要求1的方法，其中所述转基因植物细胞是在大田中生长的转基因作物植物的植物细胞，并且所述缺陷细胞是在所述大田中生长的杂草细胞。3.权利要求1的方法，其中所述转基因植物细胞是用所述多核苷酸转化的植物细胞，并且所述缺陷细胞是非转化体，且所有所述细胞在组织培养基上生长。4.控制杂草的方法，所述方法包括对作物植物和杂草应用2,4-滴除草剂，所述作物植物含有多个转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞含有由SEQIDNO:3组成的编码AAD-12蛋白的多核苷酸。5.权利要求4的方法，其中所述作物植物是双子叶植物。6.权利要求5的方法，其中所述双子叶植物是大豆植物、棉花植物或芸苔植物。7.权利要求4的方法，其中所述杂草对草甘膦具有抗性。8.控制大田中杂草的方法，其中所述方法包括对所述大田应用第一除草剂，并在应用所述第一除草剂的14天内在所述大田中种植种子，其中所述种子包括转基因植物细胞，其中所述转基因植物细胞含有由SEQIDNO:3组成的编码AAD-12蛋白的多核苷酸，且其中所述第一除草剂选自苯氧基生长素和吡啶氧基生长素。9.权利要求8的方法，其中所述第一除草剂是酸、无机盐、有机盐或酯。10.权利要求8的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·R·莱特，J·M·里拉，T·A·沃尔什，D·J·默洛，P·S·亚佳库马尔，G·林，
申请(专利权)人：美国陶氏益农公司，
类型：发明
国别省市：