一种阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系，是利用菌丝体接合转移的方式，将衍生质粒和pIJ101衍生的复制型质粒导入阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.中，实现基因的表达和敲除。本发明专利技术建立并系统优化了阿卡波糖生产菌株Actinoplanes spp.的遗传操作体系，开发了适用于该类菌株的遗传操作工具，并成功应用于精确的基因组编辑，以提高阿卡波糖产量，为实现理性设计改造阿卡波糖生产菌株奠定了基础。采用本发明专利技术的方法，加强表达阿卡波糖生物合成基因簇(acb cluster)，可使阿卡波糖发酵终产量提高35％。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术，具体涉及一种阿卡波糖生产菌Actinoplanesspp.的遗传操作体系。
技术介绍
阿卡波糖(acarbose)是一种C7环多醇类的假性四糖，可与α-葡萄糖苷酶发生竞争性结合作用，降低小肠壁细胞中的α-糖苷酶对双糖、寡糖和多糖的水解作用，以减少对葡萄糖和果糖的产生、吸收和利用，从而达到降低Ⅱ型糖尿病病人餐后血糖的目的。由于其具有良好的药代动力学性质和低毒性，而成为理想的Ⅱ型糖尿病治疗药物，其销售份额已超过传统的磺酰脲类和双胍类等降糖药物。目前工业上主要采用Actinoplanesspp.发酵生产阿卡波糖，负责其生物合成的基因簇(acbcluster)由22个结构基因组成，编码与其生物合成和转运及α-葡糖苷代谢相关的蛋白。在此基础上，借助分子生物学和基因工程手段，再辅以体外酶学分析、同位素标记喂养和质谱技术，解析了部分阿卡波糖的生物合成途径，主要包括：C7环多醇和4-氨基-4，6-二脱氧葡萄糖两个模块的合成和组装，及与麦芽糖分子的组装。国内外针对Actinoplanesspp.发酵生产acarbose进行了大量的研究工作，前期主要集中于生物合成途径的解析、高产菌株的诱变选育及发酵工艺控制与优化、分离提取工艺的研究与优化等；近年来，随着高通量测序技术的发展，对Actinoplanesspp.的基因组、转录组、蛋白质组进行测定与分析。由于缺乏有效的遗传操作体系，而使得在阿卡波糖生物合成及其调控机制、高产菌株的理性设计与改造等方面的研究受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种高效的阿卡波糖生产菌Actinoplanessp.遗传操作体系及相关的遗传操作工具；目的之二是提供一种提高阿卡波糖产量的方法。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用了以下技术方案：一种阿卡波糖生产菌Actinoplanesspp.的遗传操作体系，是利用菌丝体接合转移的方式，将衍生质粒和pIJ101衍生的复制型质粒导入阿卡波糖生产菌株Actinoplanesspp.中，实现基因的表达和敲除，具体步骤如下：A.将构建的重组质粒转化至ET12567(pUZ8002)，挑取正确的菌株，经8h培养后，转接至新鲜的LB培养基中继续培养4-5h，至OD600nm为1；B.将Actinoplanesspp.菌丝体划线于平板培养基上，30℃培养3-4天，接种至菌丝体液体培养基，培养36h后，转接至TSB培养基培养8-12h；C.将菌丝体和含有重组质粒的ET12567(pUZ8002)按照菌体数量为1：30比例混合均匀，涂布于SFM平板上，置于30℃培养箱中培养32h，每块平板分别以2mg阿泊拉霉素和甲氧苄啶覆盖，继续培养6-7天，获得接合子。通过优化菌丝体培养过程，覆盖时间，菌丝体用量，供体与受体细胞的配比，Mg2+的用量，建立可大幅度提高接合转移的效率的菌丝体接合转移体系。将pIJ101衍生的复制型质粒pJTU1278的硫链丝菌素筛选标记替换为阿泊拉霉素抗性标记，同时插入反向筛选标记CodA(sm)，获得复制型质粒pLQ752，用于Actinoplanesspp.的基因敲除、替换和插入。从阿卡波糖生产菌株Actinoplanesspp.的基因组文库中筛选到包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒，从pSET152中扩增attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR-targeting的方法插入Fosmid质粒，获得重组质粒pLQ666，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanesspp.中，实现阿卡波糖生物合成基因簇的加强表达。阿卡波糖生物合成基因簇的筛选方法是，抽提Actinoplanessp.基因组，随机打断，构建基因组文库，经筛选获得包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的fosmid质粒。通过PCR扩增获得用于acbcluster敲除的上下游同源臂，插入至复制型质粒pLQ752中，获得重组质粒pLQ757，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanesspp.中，筛选获得acbcluster缺失的突变株。利用复制型质粒pLQ752，通过同源双交换的方式，敲除编码阿卡波糖生物合成的基因簇，构建了用于C-7环醇类药物合成的微生物细胞工厂。将突变株划线于平板培养基，置于30℃培养箱培养3-4天，用接种环挑取适当菌丝体，接种于种子培养基中，置于30℃220rpm摇床中培养30-36h，按照15％的接种量接种至发酵培养基，置于30℃220rpm摇床中发酵7天，分别在发酵第3天补加2％的麦芽糖和葡萄糖。所述种子培养基的质量体积比配方为葡萄糖1％、麦芽糖1.5％、甘油1％、热榨豆饼粉4％、淀粉1％、CaCO30.2％，pH调至7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min，所述发酵培养基的质量体积比配方为麦芽糖5％、葡萄糖3％、热榨豆饼粉1％、FeCl30.05％、K2HPO40.1％、谷氨酸0.3％、CaCO30.25％，pH调至7.2，115℃高压蒸汽灭菌15min。本专利技术的具体的实施步骤如下：第一步，建立及优化菌丝体接合转移的体系首先，考察Actinoplanesspp.对常用抗生素敏感性，以便在构建遗传操作体系时选择合适的筛选标记。第二，对菌丝体的培养条件及培养时间进行优化，选择对数生长中期，生长细腻的菌丝体进行结合转移。第三，考察不同培养基对接合转移的影响。最后，优化接合转移过程的参数，如覆盖时间，菌丝体用量，供体与受体细胞的配比，培养基中添加的Mg2+浓度等。第二步，加强表达阿卡波糖生物合成基因簇首先，从Actinoplanesspp.的基因组文库中筛选包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒，插入attP-int-oriT-aac(3)IV等接合转移和整合必需的元件，然后通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanesspp.中，实现阿卡波糖生物合成基因簇的加强表达。第三步，构建复制型质粒pLQ752用于基因的敲除将复制型载体pJTU1278中的硫链丝菌素抗性基因tsr及其启动子替换成阿泊拉霉素抗性基因aac(3)IV及其启动子，同时插入反向筛选标记CodA(sm)，最终构建成用于Actinoplanesspp.高效基因敲除的复制型质粒pLQ752。第四步，acbcluster缺失突变株的构建通过PCR扩增获得用于acbcluster敲除的上下游同源臂，插入至复制型质粒pLQ752中，获得重组质粒pLQ757，通过菌丝体接合转移的方式导入Actinoplanesspp.中，筛选获得acbcluster缺失的突变株。抗生素敏感性分析的方法是：将实验室保存的三株阿卡波糖生产菌Actinoplanessp.SE50、SE50/110、HDC活化后，取新鲜菌丝划线于含有不同抗生素的平板上，30℃培养3-5d，观察菌体的生长情况。菌丝体培养条件的优化方法是：甘油保存的菌丝划线至STY培养基，培养48h后，挑取一环至SM培养基，培养约36h，以10％的接种量转接至TSB培养基中，每隔4h取一次样品，测定菌体干重。接合转移过程参数优化的方法是：(1)覆盖时间和菌丝体用量：选择不同菌丝细胞的用量为106、105、104、103(CFU)，分别培养8-36h后，取2mg阿泊拉霉素和1mg甲氧本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种阿卡波糖生产菌Actinoplanes spp.的遗传操作体系，是利用菌丝体接合转移的方式，将衍生质粒和pIJ101衍生的复制型质粒导入阿卡波糖生产菌株Actinoplanes spp.中，实现基因的表达和敲除，具体步骤如下：A.将构建的重组质粒转化至ET12567(pUZ8002)，挑取正确的菌株，经8h培养后，转接至新鲜的LB培养基中继续培养4‑5h，至OD600nm为1；B.将Actinoplanes spp.菌丝体划线于平板培养基上，30℃培养3‑4天，接种至菌丝体液体培养基，培养36h后，转接至TSB培养基培养8‑12h；C.将菌丝体和含有重组质粒的ET12567(pUZ8002)按照菌体数量为1：30比例混合均匀，涂布于SFM平板上，置于30℃培养箱中培养32h，每块平板分别以2mg阿泊拉霉素和甲氧苄啶覆盖，继续培养6‑7天，获得接合子。
【技术特征摘要】
1.一种阿卡波糖生产菌Actinoplanesspp.的遗传操作体系，是利用菌丝体接合转移的方式，将衍生质粒和pIJ101衍生的复制型质粒导入阿卡波糖生产菌株Actinoplanesspp.中，实现基因的表达和敲除，具体步骤如下：A.将构建的重组质粒转化至ET12567(pUZ8002)，挑取正确的菌株，经8h培养后，转接至新鲜的LB培养基中继续培养4-5h，至OD600nm为1；B.将Actinoplanesspp.菌丝体划线于平板培养基上，30℃培养3-4天，接种至菌丝体液体培养基，培养36h后，转接至TSB培养基培养8-12h；C.将菌丝体和含有重组质粒的ET12567(pUZ8002)按照菌体数量为1：30比例混合均匀，涂布于SFM平板上，置于30℃培养箱中培养32h，每块平板分别以2mg阿泊拉霉素和甲氧苄啶覆盖，继续培养6-7天，获得接合子。2.根据权利要求1所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanesspp.的遗传操作体系，其特征在于：所述菌丝体接合转移的方式是，通过优化菌丝体培养过程，覆盖时间，菌丝体用量，供体与受体细胞的配比，Mg2+的用量，建立可大幅度提高接合转移的效率的菌丝体接合转移体系。3.根据权利要求1所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanesspp.的遗传操作体系，其特征在于：将pIJ101衍生的复制型质粒pJTU1278的硫链丝菌素筛选标记替换为阿泊拉霉素抗性标记，同时插入反向筛选标记CodA(sm)，获得复制型质粒pLQ752，用于Actinoplanesspp.的基因敲除、替换和插入。4.根据权利要求1所述的阿卡波糖生产菌Actinoplanesspp.的遗传操作体系，其特征在于：从阿卡波糖生产菌株Actinoplanesspp.的基因组文库中筛选到包含完整阿卡波糖生物合成基因簇的Fosmid质粒，从pSET152中扩增attP-int-oriT-aac(3)IV元件，通过PCR-targeting的方法插入Fosmid质粒，获得重组质粒pLQ666，通过菌丝体接合...
【专利技术属性】
技术研发人员：白林泉，赵芹芹，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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