一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌菌株及其构建方法技术

本发明专利技术属于分子生物学和微生物发酵领域，提供一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌菌株pB2-L，该菌株的构建方法和应用。该菌株构建方法包括如下步骤：目的基因的扩增、融合片段扩增、中间载体获得、重组整合质粒获得、转化子获得及检测。本发明专利技术利用同源重组的方法，将不产抗菌物质Surfactin和Plipastatin的B.subtilis pB2，在amyE位点导入了一段融合基因P43-sfp-degQ，获得了联产Surfactin和Plipastatin的重组菌株B.subtilis pB2-L，该菌株对革兰氏阳性细菌、丝状真菌具有一定的抑菌活性，对后续研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和微生物发酵领域，涉及一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌菌株，具体涉及该枯草芽孢杆菌及其在构建过程中获得的重组质粒pDL-PSQ、该枯草芽孢杆菌的构建方法及其应用。
技术介绍
芽孢杆菌是自然界中分布非常广泛的一类革兰氏阳性细菌，其中枯草芽孢杆菌和淀粉液化芽孢杆菌作为土壤和植物微生态优势菌群，可以产生多种植物病害防治方面有广泛应用价值的脂肽类抗菌物质如：Surfactin，是由一条含有13-14个碳原子的β-羟基脂肪酸链和7个氨基酸缩肽组成的环状脂肽，作为一种很强的生物表面活性剂，还具有抗细菌、抗肿瘤、抗病毒和防止纤维蛋白凝块等生物活性。Fengycin或Plipastatin是由14-18个碳原子组成的β-羟基脂肪酸和成环十肽两部分组成；对丝状真菌具有很好的抑制活性。Surfactin和Plipastatin均是由芽孢杆菌中的非核糖体肽合成酶系催化产生的次级代谢产物，在合成过程中，4’-磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(由sfp基因编码)是必不可少的功能酶，如若缺失，将不能生产Surfactin和Plipastatin。同时，degQ基因是一种多效性的调控基因，有研究表明，该基因对Plipastatin的合成具有上调控作用。B.subtilispB2基因组中含有完整的Surfactin合成酶srfA操纵子和Plipastatin合成酶pps操纵子，但由于sfp基因和degQ基因碱基突变失活，导致B.subtilispB2不能生产Surfactin和Plipastatin。由于产环脂肽类化合物的野生型芽孢杆菌都难以被转化，限制了非核糖体肽合成酶系的进一步研究，B.subtilispB2作为模式菌枯草芽孢杆菌，其转化方法已成熟，如若利用同源重组的方法，将有功能活性的sfp基因和degQ基因导入B.subtilispB2基因组中，使其恢复生产Surfactin和Plipastatin的能力，则会对后续Plipastatin合成酶的结构与功能的深入研究提供先决条件，同时开发具有新的微生物来源的脂肽类化合物的潜力。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种运用同源重组的方法，将有功能活性的sfp基因和degQ基因一起整合到枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)pB2基因组的解淀粉酶基因amyE位点上，筛选获得了一株联产Surfactin和Plipastatin的重组菌株B.subtilispB2-L。本专利技术目的通过如下手段获得：1.本专利技术提供一种枯草芽孢杆菌菌株，该菌株联产Surfactin和Plipastatin，命名为pB2-L，在2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.11723，分类名为：枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.本专利技术还提供一种重组质粒pDL-PSQ，该重组质粒序列如SEQIDNO.1所示，包括sfp基因和degQ基因。3.上述2提供的重组质粒pDL-PSQ，该重组质粒以P43基因为启动子，amyE为同源臂。4.本专利技术还提供一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌工程菌的构建方法，该方法包括如下步骤：(1)设计引物对P43-F和P43-R、sfp-F和sfp-R、degQ-F和degQ-R：以B.subtilisfmbJ的基因组DNA为模板，PCR扩增sfp基因和degQ基因；以B.subtilispB2基因组DNA为模板，PCR扩增启动子P43基因；(2)设计引物对PS-F和PS-R，通过重叠延伸PCR扩增，获得融合片段P43-sfp；(3)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将degQ基因片段插入质粒pDL的酶切位点之间得到质粒pDL-degQ；(4)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将融合片段P43-sfp插入质粒pDL-degQ，最后获得重组整合质粒pDL-PSQ；(5)将重组整合质粒pDL-PSQ转入B.subtilispB2菌株中，通过同源臂位点交换，将目的基因P43-sfp-degQ整合到了基因组中，抗性筛选，获得阳性转化子，即为联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌工程菌，命名为B.subtilispB2-L。5.上述4提供的构建方法，其中，步骤(1)通过PCR扩增，在启动子P43基因中引入EcoRI酶切位点，在sfp基因中引入BamHI酶切位点，在degQ基因中引入BamHI和SacI酶切位点。6.上述4提供的构建方法，其中，步骤(1)所述引物对序列如下：P43-F：如SEQIDNO.2所示；P43-R：如SEQIDNO.3所示；sfp-F：如SEQIDNO.4所示；sfp-R：如SEQIDNO.5所示；degQ-F：如SEQIDNO.6所示；degQ-R：如SEQIDNO.7所示。7.上述4提供的构建方法，其中，步骤(2)所述引物对序列如下：PS-F：如SEQIDNO.8所示；PS-R：如SEQIDNO.9所示。8.根据上述4-7任一项提供的方法获得的联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌。9.上述8提供的枯草芽孢杆工程菌在革兰氏阳性细菌、丝状真菌抑制方面的应用。10.上述8提供的枯草芽孢杆工程菌在桃软腐病菌防治方面的应用。有益效果：本专利技术利用同源重组的方法，将一株不产抗菌物质Surfactin和Plipastatin的B.subtilispB2，在amyE位点导入了一段融合基因P43-sfp-degQ，获得了一株联产Surfactin和Plipastatin的重组菌株B.subtilispB2-L，该菌株对革兰氏阳性细菌、丝状真菌具有一定的抑菌活性。本专利技术采用的枯草芽孢杆菌是被我国农业部列为可在农业领域及其食品领域得到广泛的应用安全菌株。产生的抗菌脂肽Surfactin和Plipastatin属于微生物天然抗菌肽，对人类健康和食品安全性高，不会导致对环境的污染，可用于生物防治，食品加工和农产品贮藏保鲜等。本专利技术建立了一套枯草芽孢杆菌化学转化和同源重组方法，对后续研究Plipastatin合成酶系结构与功能基础理论具有重要意义。附图说明图1功能基因sfp和degQ核苷酸序列在NCBI数据库上比对分析A图：功能基因sfp与Bacillus.amyloliquefacienssubsp.plantarumUCMB506本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株联产Surfactin和Plipastatin，命名为pB2‑L，在2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.11723。

【技术特征摘要】
1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：该菌株联产Surfactin和Plipastatin，命名为
pB2-L，在2015年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号
为CGMCCNo.11723。
2.一种重组质粒pDL-PSQ，其特征在于：该重组质粒序列如SEQIDNO.1所示，包括sfp
基因和degQ基因。
3.权利要求2所述的重组质粒pDL-PSQ，其特征在于：该重组质粒以P43基因为启动子，
amyE为同源臂。
4.一种联产Surfactin和Plipastatin的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，该方
法包括如下步骤：
(1)设计引物对P43-F和P43-R、sfp-F和sfp-R、degQ-F和degQ-R；以B.subtilisfmbJ的
基因组DNA为模板，PCR扩增sfp基因和degQ基因；以B.subtilispB2基因组DNA为模板，PCR
扩增启动子P43基因；
(2)设计引物对PS-F和PS-R，通过重叠延伸PCR扩增，获得融合片段P43-sfp；
(3)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将degQ基因片段插入质粒pDL的酶切位
点之间得到质粒pDL-degQ；
(4)用限制性内切酶进行酶切，并通过连接反应将融合片段P43-sfp插入质粒pDL-
degQ，最后获得重组整合质粒pDL-PSQ；
(5)将重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：别小妹，高玲，陆兆新，吕凤霞，赵海珍，张充，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32