一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法技术

本发明专利技术属于代谢工程及发酵工程技术领域，特别涉及一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法。为了解决现有技术中酶法生产磷脂酰丝氨酸生产成本高、不易获得的问题，本发明专利技术提供了一株谷氨酸棒杆菌基因工程菌，该菌株是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变基因serAΔ197基因和CDP-甘油二酯合成酶的表达基因cdsA基因而获得。所述菌株经发酵法制备磷脂酰丝氨酸产量较出发菌株提高17-39％。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于代谢工程及发酵工程
，特别涉及一株谷氨酸棒杆菌及其过量合成磷脂酰丝氨酸的方法。
技术介绍
：磷脂酰丝氨酸(PS)广泛存在于动植物及微生物的生物膜中，是一种重要的磷脂成分。动物组织的磷脂中PS的含量非常低，仅为总磷脂的2％～10％，PS在人体内不能由自身完全合成，主要通过外界食物摄取，虽然含量低，但却有着重要的生理功能。PS可帮助脑细胞储存和读取资料、影响脑内化学信息的传递，是维持大脑正常反应和健康情绪的重要营养元素。PS在治疗阿耳茨海默(氏)病、儿童多动症和抑郁症上具有很好的效果。PS的制备方法比较多，其中主要以提取法和酶转化法为主。提取法主要运用有机溶剂将动植物原料中的PS萃取出来，但这种方法有很多限制因素。动物提取方法主要从牛脑和内脏中提取PS，但因疯牛病等不安全疾病而被质疑；植物中PS含量低，提取量低，并且很难提取高纯度的PS，从而增加了分离纯化的成本，造成PS价格的居高不下。与提取法相比，生物酶法是利用磷脂酰胆碱为基质，加入L-丝氨酸，在磷脂酶D(phospholipaseD，PLD)的作用下，生成磷脂酰丝氨酸(PS)，此方法反应条件温和，产品安全级别高，但PLD的生产成本高，不易获得，成为了生产PS的主要瓶颈。PS作为磷脂成分之一存在于微生物体内，因此利用遗传工程手段获得一株PS合成高的工程菌株为PS的制备提供了新的思路，其中大肠杆菌和酵母菌提取磷脂已有报道，但大肠杆菌并非食品安全菌株，酵母菌也因其生长较缓慢限制了其产业化。谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)作为一种兼性好氧的革兰氏阳性菌，自1957年被分离出来以后，它便逐渐成为全世界范围内氨基酸生产的主要菌株。谷氨酸棒状杆菌是一种食品级的微生物，并且基因操作载体系统完善，因其生长迅速、培养条件简单、耐受性强、发酵条件成熟，是可将PS产业化的潜力菌株。C.Glutamicum中PS可由前体物质L-丝氨酸和CDP-甘油二酯在磷脂酰丝氨酸合成酶的作用下生成。运用代谢工程原理，对前体物质L-丝氨酸和CDP-甘油二酯代谢途径中的关键酶进行遗传修饰或优化，改变碳流分布，使更多碳流量进入PS合成途径，有利于目的产物PS的合成。C.glutamicum中存在L-丝氨酸的分解代谢途径，Netzer等人[NetzerR,Peters-WendischP,EggelingL,etal.Cometabolismofanongrowthsubstrate:L-serineutilizationbyCorynebacteriumglutamicum.ApplEnvironMicrobiol,2004,70:7148–7155]证明了丝氨酸脱氨酶(sdaA编码)能够催化L-丝氨酸分解为丙酮酸，因此阻断该途径有利于PS前体物质L-丝氨酸的积累。有报道称谷氨酸棒杆菌3-磷酸甘油酸脱氢酶(serA编码)在缺失C末端197个氨基酸后可以解除来自L-丝氨酸的反馈抑制作用[Peters-WendischP,NetzerR,EggelingL.etal.3-PhosphoglyceratedehydrogenasefromCorynebacteriumglutamicum:theC-terminaldomainisnotessentialforactivitybutisrequiredforinhibitionbyL-serine[J].ApplMicrobiolBiotechnol,2002,60(4):437-441]，从而有利于PS前体物质L-丝氨酸的合成。同时，过表达CDP-甘油二酯合成酶(cdsA编码)可提高PS前体物质CDP-甘油二酯在代谢途径中的含量。另外，磷脂酰丝氨酸合成酶(pssA编码)可以L-丝氨酸和CDP-甘油二酯为前体物质，催化合成PS，因此提高其表达量，有利于产物PS的合成。本专利技术旨在提供一株过量合成磷脂酰丝氨酸谷氨酸棒杆菌及其生产磷脂酰丝氨酸的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决上述技术问题所采用的技术方案之一：是提供一种高产磷脂酰丝氨酸(PS)的谷氨酸棒杆菌工程菌，用于过量合成PS。所述工程菌，是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的突变基因serAΔ197基因和CDP-甘油二酯合成酶的表达基因cdsA基因；所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；所述serAΔ197基因来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.2所示；所述cdsA基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.3所示。优选的，所述磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因为pssAM基因；优选的，所述CDP-甘油二酯合成酶的表达基因为cdsAM基因；优选的，所述工程菌，是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的突变基因pssAM基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶突变基因serAΔ197基因和CDP-甘油二酯合成酶突变基因cdsAM基因；所述pssAM基因，是将来源于E.coliK12的pssA基因进行了密码子优化所得，可提高PS在谷氨酸棒杆菌中15％以上的表达量，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.4所示；所述serAΔ197基因，缺失了谷氨酸棒杆菌中3-磷酸甘油酸脱氢酶C端的197个氨基酸，可解除丝氨酸反馈抑制，该基因来源于谷氨酸棒杆菌ATCC13032；所述cdsAM基因，是cdsA基因的突变基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.5所示，其表达产物A74R的氨基酸序列如SEQIDNo.6所示，是将谷氨酸棒杆菌中原始CDP-甘油二酯合成酶的第74位氨基酸Ala突变为Arg，酶活提高10％以上；所述工程菌株具体为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)M-1，该菌株已于2015年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.11923。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案之二：是提供技术方案一所述工程菌株的制备方法，具体如下：(1)谷氨酸棒杆菌sdaA缺失菌株的构建；(2)扩增pssA或pssAM基因序列，连接至pXMJ19，构建重组质粒pXMJ19-pssA或pXMJ19-pssAM；(3)以谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组DNA为模板，扩增serA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌，是将谷氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L‑丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因pssA基因、3‑磷酸甘油酸脱氢酶的表达基因serAΔ197基因和CDP‑甘油二酯合成酶的表达基因cdsA基因；所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述serAΔ197基因来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；所述cdsA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.3所示。

【技术特征摘要】
1.一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述工程菌，是将谷
氨酸棒杆菌宿主细胞中表达L-丝氨酸脱氨酶的sdaA基因进行敲除，并串联表达磷脂酰丝氨
酸合成酶的表达基因pssA基因、3-磷酸甘油酸脱氢酶的表达基因serAΔ197基因和CDP-甘油二
酯合成酶的表达基因cdsA基因；
所述pssA基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.1所示；
所述serAΔ197基因来源于谷氨酸棒状杆菌ATCC13032，其核苷酸序列如序列表SEQID
No.2所示；
所述cdsA基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.3所示。
2.如权利要求1所述的一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所
述磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因为pssAM基因，pssAM基因为pssA基因的突变基因，其核
苷酸序列如序列表SEQIDNo.4所示。
3.如权利要求1所述的一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所
述CDP-甘油二酯合成酶的表达基因为cdsAM基因，cdsAM基因为cdsA基因的突变基因，其
核苷酸序列如序列表SEQIDNo.5所示。
4.如权利要求1所述的一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所
述磷脂酰丝氨酸合成酶的表达基因为pssAM基因，pssAM基因为pssA基因的突变基因，其核
苷酸序列如序列表SEQIDNo.4所示；所述CDP-甘油二酯合成酶的表达基因为cdsAM基因，
其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.5所示。
5.一种CDP-甘油二酯合成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如序列表
SEQIDNo.6所示。
6.权利要求5所述CDP-甘油二酯合成酶突变体的编码基因，其特征在于，所述基因为
cdsAM基因，其核苷酸序列如序列表SEQIDNo.5所示。
7.如权利要求4所述一种高产磷脂酰丝氨酸的谷氨酸棒杆菌工程菌，其特征在于，所述
工程菌具体为谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)M-1，保藏编号...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘逸寒，路福平，李瑞，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12