本发明专利技术涉及一种多核苷酸，该多核苷酸对于与来自谷氨酸棒状杆菌的鸟氨酸或精氨酸生物合成相关的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶具有活性。本发明专利技术还涉及由所述多核苷酸编码的多肽，包括所述多核苷酸的重组载体，通过将所述重组载体引入到用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的宿主微生物中，并且转化该重组载体而获得的转化体，以及通过培养所述转化体来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。与内在活性相比较，本发明专利技术的转化体对于乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的活性增加，并且因此可以以高产率从本发明专利技术的转化体中生产L-鸟氨酸或L-精氨酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的棒状杆菌(Corynebacterium)变异体以及用于生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。更具体地，本专利技术涉及编码参与鸟氨酸或精氨酸生物合成的乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者的谷氨酸棒杆菌来源的多核苷酸、由该多核苷酸编码的多肽、携带该多核苷酸的重组载体、通过将该重组载体引入到生产L-精氨酸的宿主生物中而制备的转化体，以及通过培养该转化体来生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的方法。
技术介绍
L-氨基酸被用作用于人的药物中的成分并且特别地应用于制药工业和食品工业并且也被用作用于动物的营养物。在L-氨基酸中，L-鸟氨酸，在精氨酸循环上的产物之一，已知是增强肝功能的药物组分(Salvatore等人，1964)。L-精氨酸以游离形式大量地存在于植物种子和大蒜中并且在药物或食品产品中用作营养增补剂。L-精氨酸的药物应用的实例包括抗-肝毒物质、脑代谢增强剂、用于雄性不育的治疗剂、以及一般性氨基酸剂型(配方)。应用了 L-精氨酸的食物中的代表是鱼糊添加剂、健康饮料添加剂以及用于患有高血压的患者的盐替代物。当棒状杆菌(尤其是谷氨酸棒状杆菌)用于大量生产氨基酸时，发酵得以应用。由于在工业方面其高显著性，氨基酸的细菌生产方法连续地改善。就例如在发酵过程中搅拌、氧气引入、以及糖浓度的维持而言，已经实现了方法上的改进。为了增加氨基酸的微生物生产率，选择适当的微生物是非常重要的。可以选择产生L-氨基酸的菌株，这些菌株对于抗代谢物质具有耐受性或对于负责氨基酸调节的代谢 产物是营养缺陷的。例如，使用生产谷氨酸的短杆菌或棒状杆菌的变异体来生产鸟氨酸(EP0393708A3)。而且，使用生产谷氨酸的短杆菌或棒状杆菌的变异体来从碳和氮源直接生产L-精氨酸(日本专利公开号Sho. 57-163487,60-83593以及62-265988)。重组DNA技术也是一种有用的工具，可以通过它来基因上改变生产L-氨基酸的棒状杆菌株从而增强与生产L-氨基酸相关的功能。例如，可以将argCJBD (—种鸟氨酸生物合成基因)引入到并且过表达在不能合成精氨酸和脯氨酸的菌株中(Hwang等人，2008)。而且，可以对菌株进行基因重组用于使argR (—种抑制精氨酸生物合成操纵子的表达的基因)失活(美国专利申请公开号2002/0045223A1)。通过加强感兴趣基因的生物合成可以实现氨基酸生产率的增加。存在这样的报告，即可以通过增加生物合成基因的表达来提高氨基酸生产的产率。例如，精氨酸生物合成基因argF的过表达导致精氨酸的生产增加(韩国专利申请号10-2004-107215)。此外，披露了一种用于生产L-精氨酸的方法，其中argD2基因(Ncgl2355)或(Ncgl0990)，一种涉及谷氨酸棒状杆菌的精氨酸生物合成的乙酰鸟氨酸氨基转移酶的推定基因，被过表达用于以高产率生产L-精氨酸(韩国专利号0830289和0830290)。与此类似，能够以高产率生产鸟氨酸或精氨酸的微生物菌株可能是由于生物合成基因的增强，尤其是生物合成酶乙酰谷氨酸合酶以及乙酰鸟氨酸酶的基因导致的。然而，在迄今已知的棒状杆菌中尚未发现乙酰谷氨酸合酶。在本专利技术中，本专利技术检查了对负责乙酰谷氨酸合酶功能的酶进行编码的基因。已经报道了该基因的多肽具有类似于由argj编码的乙酰鸟氨酸酶的活性。此外，已经发现该基因活性的增强增加了鸟氨酸或精氨酸的浓度。基于这些研究结果，完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题因此本专利技术的一个目的是提供一种对具有乙酰谷氨酸合酶或乙酰鸟氨酸酶活性的多肽进行编码的新型棒状杆菌来源的多核苷酸，或由此编码的多肽。本专利技术的另一个目的是提供其中该基因被过表达并且对于鸟氨酸或精氨酸具有改善的生产率的菌株。本专利技术的另一个目的是提供使用该菌株以高浓度来生产鸟氨酸或精氨酸的方法。技术方案根据其一个方面，本专利技术提供了一种显示乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶活性的谷氨酸棒状杆菌来源的多肽。在本专利技术中，发现基因Ncgll469 (其序列可通过国立卫生研究院(NationalInsititute of Health)的数据库公开地得到)编码乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者。在棒状杆菌中，对乙酰谷氨酸进行编码的基因尚未被确定，然而报道了通过argj来编码乙酰鸟氨酸酶(Sakayan等人，1996)。在本专利技术之前的文件均没有披露基因Ncgll469编码这两种酶。它的氨基酸和核苷酸序列分别给出为SEQ ID N0S. I和2。根据其另一个方面，本专利技术提供了携带对乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶两者进行编码的基因的载体。该载体包含乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶基因。可用作本专利技术载体的质粒的实例包括pZl (menkel等人)、pEkExl (Eikmarms等人)、pHS2_l (Sonnen等人)、pCG4 (美国专利号 4, 489, 190)、pNG2 (Serwold-Davis 等人)以及 pEKO (Eikmanns 等人)，其中优选pEKO。更优选地，该载体包含SEQ ID NO. I的氨基酸序列或SEQ ID NO. 2的核苷酸序列并且示于图I中。根据其另外的方面，本专利技术提供了富含乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的微生物、或转化体或重组细胞。在该上下文中，该菌株可以是在增强乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶之前已经能够生产L-鸟氨酸或L-精氨酸的菌株。本领域技术人员根据任何已知的转化方法可以容易地制备该转化体。如本文中使用的，术语“转化”用于指由于外源性DNA的摄取、结合、复制和表达引起的细胞的基因改变。典型的典型转化方法是CaCl2沉淀、基于CaCl2沉淀使用DMSO (二甲亚砜)作为还原剂的Hanahan法、电穿孔、磷酸钙沉淀、原生质融合(血浆融合)、碳化硅纤维介导的转化、农杆菌介导的转化、PEG-介导的转化、硫酸葡聚糖法、阳离子脂质体法(Lipofectaminemethod)、以及干燥/抑制介导的转化。例如，在本专利技术中，通过电穿孔将重组载体pEK-Ptrc: :1469引入到宿主微生物中以产生转化体，然后利用抗菌素耐受性来分离该转化体。表达“相对于内在活性增强”用于指与内在活性相比引入的酶乙酰谷氨酸合酶和乙酰鸟氨酸酶的细胞内活性的优越性。通过增加感兴趣基因的拷贝可以实现酶活性的增强。可以通过使用载体(例如质粒)，或通过将另外的基因整合到染色体中来增加基因拷贝的数量。调节元件(该元件对基因表达具有正面影响)的增强可以是用于增加基因拷贝数的一种途径。该调节元件可以在转录水平上增强基因活性，并且特别地可以用于增强转录信号。可替换地，例如可以通过增加mRNA的稳定性在翻译水平上实现该增强。可以使用具有高活性的感兴趣的基因。感兴趣基因的过表达可能是由培养基构成的改变引起的。可以通过增强其启动子或使用更强的启动子来增加基因的活性。可用于本专利技术的强启动子的一个实例是Tac-启动子(Amann等人)。通过突变可以增强基因的内在活性。可以通过常规方法使用UV光或诱变化学剂或通过基于核苷酸残基的缺失、插入和/或取代的基因操作方法来引入突变。可以将上述措施结合以增强酶的活性。可以将棒形菌、棒状杆菌或短杆菌用于本专利技术中。适合于制备转化的谷氨酸棒状杆菌变异体的起始菌株的实例包括下面的野本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.01.06 KR 10-2010-00007261.一种源自谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)的多肽，具有SEQ IDNO. I的氨基酸序列，显示出こ酰谷氨酸合酶和こ酰鸟氨酸酶二者活性。2.—种由SEQ ID NO. 2表示的多核苷酸，编码权利要求I所述的多肽。3.ー种携带权利要求2所述的多核苷酸的重组载体pEK-Ptrc: :Ncgll469,如图2中说明的。...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵镇满，金蕙园，李智惠，赵栽熔，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：
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