本公开涉及一种生产聚‑4‑羟基丁酸酯和/或1,4‑丁二醇的新方法，以及一种使用聚‑4‑羟基丁酸酯生产途径的微生物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
[]本公开涉及一种生产聚-4-羟基丁酸酯和/或1,4-丁二醇的新方法，以及一种使用聚-4-羟基丁酸酯生产途径的微生物。
技术介绍
0、[
技术介绍
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1、为了生产1,4-丁二醇，正在进行各种研究，以开发用于高效生产的微生物和发酵工艺技术。利用微生物生产1,4-丁二醇通常伴随着4-羟基丁醛生产反应(us 9121042 b2)。然而，4-羟基丁醛是一种醛，缺点在于对微生物有害。
2、此外，目前已知的1,4-丁二醇生物生产技术之一是在微生物中通过发酵直接从葡萄糖生产1,4-丁二醇的方法，即1,4-丁二醇的直接发酵。然而，由于1,4-丁二醇本身对微生物有毒性，生产率存在限制。因此，仍有需要研究如何有效提高聚-4-羟基丁酸酯和/或1,4-丁二醇的生产能力。
3、[公开]
4、[技术问题]
5、本公开要解决的问题是提供一种生产聚-4-羟基丁酸酯和1,4-丁二醇的新的方法，以及一种用于生产聚-4-羟基丁酸酯和/或1,4-丁二醇的微生物。
6、[技术方案]
7、本公开的一个目的是提供一种生产1,4-丁二醇的方法。
8、本公开的另一个目的是提供一种用于生产聚-4-羟基丁酸酯和/或1,4-丁二醇的微生物。
9、本公开的另一个目的是提供一种生产聚-4-羟基丁酸酯的方法。
10、[专利技术的效果]
11、当使用本公开的方法或微生物时，可以有效地生产聚-4-羟基丁酸酯和1,4-丁二醇。
12、[附图简介]
13、图1展示了使用氧化tca循环的聚-4-羟基丁酸酯和1,4-丁二醇的生产途径；
14、图2展示了使用还原tca循环的聚-4-羟基丁酸酯和1,4-丁二醇的生产途径；
15、图3展示了使用乙醛酸循环的聚-4-羟基丁酸酯和1,4-丁二醇的生产途径；
16、图4至图6展示了使用还原性tca循环在聚-4-羟基丁酸酯和1,4-丁二醇生产途径中增强磷酸烯醇式丙酮酸-草酰乙酸途径的方法；
17、图7展示了使用还原性tca循环生产聚-4-羟基丁酸酯的结果；以及
18、图8展示了使用乙醛酸循环生产聚-4-羟基丁酸酯的结果。
19、[优选实施方案的详细描述]
20、下面将详细介绍本公开内容。同时，本公开中披露的每种描述和实施方案也可适用于其他描述和实施方案。也就是说，本公开中披露的各种要素的所有组合都落入本公开的范围。此外，本公开的范围不受下文具体描述的限制。此外，本说明书中还参考和引用了许多论文和专利文件。所引用的论文和专利文件的公开内容通过引用的方式以其整体并入本文，以进一步明确本公开所涉及的主题的层次和范围。
21、本公开的一个方面提供了一种生产1,4-丁二醇的方法，该方法包括以下(1)至(5)：
22、(1)将琥珀酰-coa(sucoa)转化为琥珀酸半醛(succinate semialdehyde,ssa)；
23、(2)将琥珀酸半醛(ssa)转化为4-羟基丁酸(4-hydroxybutyrate,4hb)；
24、(3)将4-羟基丁酸(4hb)转化为4-羟基丁酰coa(4hbcoa)；
25、(4)通过聚合两个或更多的4-羟基丁酰基coa(4hbcoa)，产生聚-4-羟基丁酸酯(p4hb)；以及
26、(5)将聚-4-羟基丁酸酯降解为1,4-丁二醇。
27、(1)至(4)可分别使用选自由以下组成的组中的任意一种或多种：选自由琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-coa转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶组成的组中的任意一种或多种多肽；包括所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体，或其组合的微生物；及其培养物，但不限于此。
28、选自由琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-coa转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶组成的组中的任意一种或多种可以通过包括外来多肽、编码外来多肽的多核苷酸或包括多核苷酸的载体的微生物来增强，但不限于此。
29、在通过葡萄糖发酵直接生产1,4-丁二醇的过程中，由于1,4-丁二醇对微生物的毒性，生产率存在限制。与此相反，在本公开内容中，优选地生产细胞友好型的聚-4-羟基丁酸酯，因此，本公开内容的生产方法可增加聚-4-羟基丁酸酯的生产率。此外，本公开内容还可通过以下增加聚-4-羟基丁酸酯的生产率：使用草酰乙酸激活还原性tca循环；高生产率发酵过程；和/或通过在生产聚-4-羟基丁酸酯的过程中引入基因而经过还原性tca循环回收发酵产生的二氧化碳。此外，1,4-丁二醇的生产率可根据聚-4-羟基丁酸酯生产率的增加而进一步增加。
30、本公开的生产1,4-丁二醇的方法可进一步包括选自tca循环、还原性tca循环和乙醛酸循环的任何一个或多个循环。所述循环可引起向琥珀酰-coa的转化。
31、在一个实施方案中，本公开的1,4-丁二醇生产方法可包括tca循环。此时，一分子葡萄糖可经过糖酵解循环转化为丙酮酸，其可经过tca循环转化为琥珀酰-coa。
32、tca循环可包括选自由以下组成的组中的任何一种或多种：(a1)将丙酮酸转化为乙酰-coa；(b1)将乙酰-coa和草酰乙酸转化为柠檬酸；(c1)将柠檬酸转化为异柠檬酸；(d1)将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸；(e1)将α-酮戊二酸转化为琥珀酰-coa；以及(f1)将丙酮酸转化为草酰乙酸。
33、(d1)可以是将异柠檬酸转化为α-酮戊二酸和二氧化碳，(e1)可以是将α-酮戊二酸转化为琥珀酰-coa和二氧化碳。
34、在一个实施方案中，(a1)至(f1)可分别使用选自由以下组成的组中的任何一种或多种：选自丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶的任意一种或多种多肽；包括所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体，或其组合的微生物；及其培养物，但不限于此。
35、所述生产方法可进一步包括(g1)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸，但不限于此。
36、在一个实施方案中，(g1)可使用选自由以下组成的组中的任何一种或多种：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶多肽；包括该多肽、编码该多肽的多核苷酸、包括该多核苷酸的载体、或其组合的微生物；及其培养物，但不限于此。
37、在一个实施方案中，在本公开的生产方法中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的转录在选自氮、硫、磷和镁中的一种或多种的限制条件下不受抑制，但不限于此。
38、在一个实施方案中，本公开的生产方法可包括限制选自氮、磷、硫和镁中的一种或多种，但不限于此。
39、在一个实施方案中，即使本公开的生产方法包括限制选自氮、磷、硫和镁中的一个或多个，但与不包括限制步骤的方法相比，所述方法可能不降低聚-4-羟基丁酸酯和/或1,4-丁二醇的产量，但不限于此。
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【技术保护点】
1.一种生产1,4-丁二醇的方法，所述方法包括：
2.权利要求1的方法，其中(1)至(4)分别使用选自由以下组成的组中的任意一种或多种：选自由琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶组成的组中的任意一种或多种多肽；包括所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体，或其组合的微生物；及其培养物。
3.权利要求1的方法,进一步包括TCA循环。
4.根据权利要求3的方法，其中所述TCA循环包括选自由以下组成的组中的任意一种或多种
5.权利要求1的方法，进一步包括(g1)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中(g1)使用选自由以下组成的组中的任何一种或多种：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶多肽；包括该多肽、编码该多肽的多核苷酸、包括该多核苷酸的载体、或其组合的微生物；及其培养物。
7.权利要求1的方法，其中(g1)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的过程是增强的。
8.权利要求1的方法，进一步包括还原性TCA循环。
>9.如权利要求8所述的方法，其中还原性TCA循环选自由以下组成的组中的任意一个或多个：10.根据权利要求8所述的方法，其中(e2)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸的过程是削弱的。
11.根据权利要求8的方法，其中还原性TCA循环通过选自由以下(I)至(XII)组成的组中的任一种或多种得到增强：
12.权利要求1的方法，进一步包括乙醛酸循环。
13.如权利要求12所述的方法，其中乙醛酸循环进一步包括选自由以下组成的组中的任意一种或多种
14.权利要求13的方法，其中(j3)将α-酮戊二酸转化为琥珀酰-CoA是削弱的。
15.根据权利要求13所述的方法，其中(k3)将草酰乙酸转化为苹果酸的是削弱的。
16.根据权利要求13所述的方法，其中乙醛酸循环通过选自(i)至(vi)组成的组中的任意一种或多种得到增强：
17.一种微生物，其包含琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶多肽，编码所述多肽的多核苷酸，或其组合。
18.权利要求17的微生物，其中选自由琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-CoA转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶组成的组中的任何一种或多种多肽是从外部来源引入的。
19.权利要求17的微生物，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶和所述4-羟基丁酰-CoA转移酶多肽是来源于克氏梭状芽孢杆菌，所述4-羟基丁酸脱氢酶多肽来源于拟南芥，而所述聚(3-羟基烷酸)聚合酶来源于恶臭假单胞菌或富养罗尔斯通氏菌。
20.如权利要求17所述的微生物，其中所述微生物包括TCA循环。
21.如权利要求17所述的微生物，其中所述微生物包括选自由丙酮酸脱氢酶、柠檬酸合成酶、乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶、α-酮戊二酸脱氢酶和丙酮酸羧化酶组成的组中的任意一种或多种多肽，编码它们的多核苷酸，或它们的组合。
22.如权利要求17所述的微生物，其中所述微生物包括还原性TCA循环。
23.权利要求17的微生物，其中所述微生物包括选自由以下(I)至(XII)组成的组中的任意一种或多种：
24.权利要求17的微生物，其中所述微生物包括乙醛酸循环。
25.权利要求17的微生物，其中所述微生物包括选自以下(i)至(vi)组成的组中的任意一种或多种：
26.权利要求17的微生物，其中所述微生物用于生产1，4-丁二醇。
27.权利要求17的微生物，其中所述微生物用于生产聚-4-羟基丁酸酯。
28.权利要求17的微生物，其中所述微生物属于棒状杆菌属或大肠杆菌属。
29.权利要求17的微生物，其中所述微生物即使在选自氮、硫、磷和镁的一种或多种营养物质的限制条件下，仍具有生产聚-4-羟基丁酸酯的能力。
30.权利要求17的微生物，其中所述微生物包括由SEQ ID NO:45所示的具有启动子活性的核苷酸序列。
31.权利要求30的微生物，其中SEQ ID NO:45所示的具有启动子活性的核苷酸序列的靶基因是编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的多核苷酸。
32.一种生产聚-4-羟基丁酸酯的方法，所述方法包括培养权利要求17至31中任一项的微生物。
33.权利要求32的方法，进一步包括从微生物或培养基中回收聚-4-羟基丁酸酯。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种生产1,4-丁二醇的方法，所述方法包括：
2.权利要求1的方法，其中(1)至(4)分别使用选自由以下组成的组中的任意一种或多种：选自由琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-coa转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶组成的组中的任意一种或多种多肽；包括所述多肽、编码所述多肽的多核苷酸、包括所述多核苷酸的载体，或其组合的微生物；及其培养物。
3.权利要求1的方法,进一步包括tca循环。
4.根据权利要求3的方法，其中所述tca循环包括选自由以下组成的组中的任意一种或多种
5.权利要求1的方法，进一步包括(g1)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸。
6.如权利要求5所述的方法，其中(g1)使用选自由以下组成的组中的任何一种或多种：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶多肽；包括该多肽、编码该多肽的多核苷酸、包括该多核苷酸的载体、或其组合的微生物；及其培养物。
7.权利要求1的方法，其中(g1)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为草酰乙酸的过程是增强的。
8.权利要求1的方法，进一步包括还原性tca循环。
9.如权利要求8所述的方法，其中还原性tca循环选自由以下组成的组中的任意一个或多个：
10.根据权利要求8所述的方法，其中(e2)将磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸的过程是削弱的。
11.根据权利要求8的方法，其中还原性tca循环通过选自由以下(i)至(xii)组成的组中的任一种或多种得到增强：
12.权利要求1的方法，进一步包括乙醛酸循环。
13.如权利要求12所述的方法，其中乙醛酸循环进一步包括选自由以下组成的组中的任意一种或多种
14.权利要求13的方法，其中(j3)将α-酮戊二酸转化为琥珀酰-coa是削弱的。
15.根据权利要求13所述的方法，其中(k3)将草酰乙酸转化为苹果酸的是削弱的。
16.根据权利要求13所述的方法，其中乙醛酸循环通过选自(i)至(vi)组成的组中的任意一种或多种得到增强：
17.一种微生物，其包含琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-coa转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶多肽，编码所述多肽的多核苷酸，或其组合。
18.权利要求17的微生物，其中选自由琥珀酸半醛脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰-coa转移酶和聚(3-羟基烷酸)聚合酶组成的组中的任何一种或多种多肽是从外部来源引入的。
19.权利要求17的微生物，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶和所述4-羟...
【专利技术属性】
技术研发人员：金瑞亨，李庚昶，林宰亨，河孝锡，张东银，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：
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