遗传修饰的产生(R)‑乳酸的嗜热细菌制造技术

本发明专利技术涉及兼性厌氧的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含：a)内源性(S)‑乳酸脱氢酶基因的失活或缺失；b)(R)‑乳酸脱氢酶基因的引入；c)内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因的失活或缺失。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及修饰用于同型乳酸(homolactic)和对映体纯(enantiopure)(R)-乳酸生产的嗜热细菌细胞、遗传修饰的细胞和生产对映体纯(R)-乳酸的方法。乳酸及其盐(称为乳酸盐)是可用于各种领域(包括医药、生物可降解聚合物和食品加工)的商业上可行的产品。兼性厌氧的嗜热细菌(例如土芽孢杆菌属(Geobacillus)物种)似乎是乳酸工业制造的理想生物体。它们能够在37-75℃的温度下生长，最佳温度为55-65℃(Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446)，并且允许在高于50℃的温度下的厌氧工业发酵。当工业规模发酵时，该高温具有几个优点：较小的感染风险和因此更高的对映体纯度，更快的反应，更低的冷却成本等。土芽孢杆菌的兼性厌氧性质允许在厌氧条件下或至少在低的氧分压下发酵，其对于工业规模是期望的，因为其允许相对便宜的设备和加工。此外，这些细菌的营养需求比也允许相对便宜的工业过程的乳酸菌(诸如乳杆菌属(Lactobacillus)物种)的营养需求要求更低。当在厌氧条件下或至少在低氧分压下生长时，已知兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种产生乳酸。实例是热坚土芽孢杆菌(G.caldotenax)，G.caldoxylosilyticus，G.debilis，嗜热土芽孢杆菌(G.kaustophilus)，苍白土芽孢杆菌(G.pallidus)，嗜热脂肪土芽孢杆菌(G.stearothermophilus)，G.tepidimans，热反硝化土芽孢杆菌(G.thermodenitrificans)，热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidans)，喜热土芽孢杆菌(G.thermoleovorans)，G.toebii，热带土芽孢杆菌(G.tropicalis)。已知热葡糖苷酶土芽孢杆菌从木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、果糖、蔗糖和纤维二糖产生乳酸(Green等人，2003，WO03/008601)。对于工业应用，含有蔗糖、葡萄糖、木糖或阿拉伯糖或其混合物的原料是最相关的。同时利用葡萄糖和木糖的能力(Green等人，2003，WO03/008601)是热葡糖苷酶土芽孢杆菌在使用来源于木质纤维素原料的可发酵糖时的重要优点。已知的兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种的一个缺点是它们主要产生(S)-乳酸和极少的(R)-乳酸的事实。由于可生物降解的乳酸聚合物的成功应用将取决于廉价的(S)-乳酸和廉价的(R)-乳酸两者的可用性，因此需要两种对映体的成本有效的生产。目前已知的产生(R)-乳酸的细菌是嗜温的(例如左旋乳酸芽孢杆菌(Bacilluslaevolacticus)))或具有要求高的营养需求(例如德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii))，这使得(R)-乳酸的制造比(S)-乳酸的制造贵得多。已知的兼性厌氧的土芽孢杆菌属物种的另一个缺点是它们通常具有混合酸发酵的事实，产生乳酸、乙醇、乙酸和甲酸作为主要发酵产物。在本申请中，术语有机酸意在还包括其相应的盐。显然需要能够使用对于工业应用具有吸引人的特征(例如低营养需要，广泛的糖消耗能力，生产碳水解酶的能力，高生长速率，高生产力，抗渗透胁迫和遗传可及性)的用于同型乳酸和对映体纯乳酸的生产的细菌菌株(例如土芽孢杆菌属菌株)。本专利技术的目的之一是产生兼性厌氧的并通过同型乳酸发酵产生(R)-乳酸的嗜热细菌菌株。应当理解，(R)-乳酸的其它术语是D-乳酸或D(-)-乳酸。在本申请中，这些术语可互换使用。类似地，术语(S)-乳酸、L-乳酸和L(+)-乳酸可互换使用。本专利技术的另一个目的是产生兼性厌氧的并且生产对映体纯(R)-乳酸的嗜热细菌菌株。热葡糖苷酶土芽孢杆菌被描述为嗜热芽孢杆菌属(Bacillus)物种(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495；Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446；Coorevits等人,2012,Int.Syst.Evol.Microbiol.62:14770-1485)。热葡糖苷酶土芽孢杆菌先前已知为热葡糖苷酶芽孢杆菌(Bacillusthermoglucosidasius)(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495)，其由Nazina等人于2001年重命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidasius)(Nazina等人,2001,Int.J.Syst.Evol.Microbiol.51:433-446)，并且后来由Coorevits等人重命名为热葡糖苷酶土芽孢杆菌(G.thermoglucosidans)(Coorevits等人,2012,Int.Syst.Evol.Microbiol.62:14770-1485)。从土壤中分离该类型的菌株(Suzuki等人,1976,Appl.Environ.Microbiol.31:807-812)。尽管最初报道为严格需氧的，但后来的研究报道兼性厌氧生长和(S)-乳酸生产(Green等人,2003,WO03/008601；Fong等人,2006,Extremophiles10:363-372)。温度范围为42至69℃，最佳为62℃(Suzuki等人,1983,Syst.Appl.Microbiol.4:487-495)。已经报道了用于乙醇生产的热葡糖苷酶土芽孢杆菌菌株的遗传修饰(Green等人,2001,WO01/49865；Atkinson等人,2008,WO08/038019)。这包括用于热葡糖苷酶土芽孢杆菌DSM2542T的遗传工具和破坏L-乳酸脱氢酶(ldh)基因的方法的描述(Atkinson等人,2006,WO2006/117536和2008,WO2008/038019)。已报道了热葡糖苷酶土芽孢杆菌M10EXG的在木糖和葡萄糖上生长的细胞的代谢途径和通量(Tang等人2009,Biotechnol.Lett.102:1377-1386)。土芽孢杆菌属物种中乳酸脱氢酶(ldhL)的失活已被显示优化乙醇生产(Payton等人,1985,FEMSMicrobiol.Lett.26:333-336；Green等人,2001；Atkinson等人,2006,WO2006/117536；Cripps等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)。Cripps等人显示热葡糖苷酶土芽孢杆菌NCIMB11955的ldhL-衍生体显示出分批发酵中乳酸生产的强烈减少，但不是完全消除，而乙醇、甲酸盐和丙酮酸盐的产生增加。编码丙酮酸甲酸裂解酶的ldhL和pflB的组合突变消除了甲酸盐的产生(Cripps等人,2009,Metab.Eng.11:398-408)。异源基因表达似乎在热葡糖苷酶土芽孢杆菌中是有问题的。运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)丙酮酸脱羧酶的功能性酶仅在52℃(该温度为热葡糖苷酶土芽孢杆菌的亚最适温度)生长而非在54℃、56℃或58℃生长时产生(Thompson等人,2008,Biotechnol.Lett.30:本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兼性厌氧的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含：a)内源性(S)‑乳酸脱氢酶基因的失活或缺失；b)(R)‑乳酸脱氢酶基因的引入；c)内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因的失活或缺失。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.23 EP 14178144.31.一种兼性厌氧的遗传工程化的嗜热细菌细胞，其包含：a)内源性(S)-乳酸脱氢酶基因的失活或缺失；b)(R)-乳酸脱氢酶基因的引入；c)内源性丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因的失活或缺失。2.权利要求1所述的细胞，其中内源性甲基乙二醛合成酶基因mgsA也被失活或缺失。3.权利要求1或2所述的细胞，其中所述(R)-乳酸脱氢酶是来自德氏乳杆菌的编码SEQIDNO：38的氨基酸序列或具有至少90％同一性的氨基酸序列的hdhD基因。4.权利要求1或2所述的细胞，其中所述(R)-乳酸脱氢酶是来自德氏乳杆菌的编码SEQIDNO：36的氨基酸序列或具有至少90％同一性的氨基酸序列的ldhA基因。5.权利要求3所述的细胞，其中所述hdhD基因编码SEQIDNO：38的氨基酸序列。6.权利要求4所述的细胞，其中所述ldhA基因编码SEQIDNO：36的氨基酸序列。7.权利要求1-6所述的细胞，其中内源性磷酸转乙酰酶基因(pta)也被失活或缺失。8.权利要求1-7所述的细胞，其是由于内源性孢子生成基因的失活或缺失而产生的孢子生成缺陷型衍生体。9.权利要求8所述的细胞，其中所述孢子生成基因是sigF。10.权利要求1-9所述的细胞，其中所述丙酮酸甲酸裂解酶A和/或B基因通过内源性丙酮酸甲酸裂解酶/醇脱氢...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·P·马切尔森，M·范哈特斯坎普，R·范克拉嫩堡，
申请(专利权)人：普拉克生化公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL